野葛花不同发育期射干苷和染料木素含量经时对比研究

石金敏 董勇强 周灿 余绪明 柯静 王林海

1十堰市人民医院 湖北医药学院附属人民医院药学部，十堰 442000；2华中农业大学植物科学技术学院，武汉 430070；3湖北医药学院药学院，十堰 442000

葛花为豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.） Ohwi或甘葛藤P. thomsoniiBenth的花，我国资源非常丰富，各标准中记载的葛花质量标准入药部位花、花蕾及花和花蕾不一，且仅收载有药材的来源、性状鉴别项，未见含量测定项［1-6］。不同产地由于气候、海拔等条件的不同，药材有效成分的积累存在差异，采收时间略有不同［7-8］，葛花在采收、质量控制等方面缺乏系统的研究，射干苷和染料木素等异黄酮类为其主要活性成分［9-12］，本研究拟通过测定不同采收期道地产区武当山野葛花不同用药部位花和花蕾中射干苷和染料木素等黄酮类的含量，为葛花质量标准的提高及采收期的确定提供数据支持。

材料

1.仪器

高效液相色谱仪（LC-20AT，日本岛津公司），万分之一电子分析天平（CP214，奥豪斯中国有限公司）。

2.药品与试剂

射干苷（批号：wkq19020212，纯度≥98%）、染料木素（批号：wkq16081203，纯度≥98%）购自四川维克奇生物科技有限公司。乙腈为色谱纯，甲醇、磷酸为分析纯。野葛花不同发育期样品（花蕾、花）采自武当山，采集时间为2022年立秋前后，每4日采集药材样本，花开放周期大约为1个月，采集时间依次为2022-08-03、2022-08-07、2022-08-11、2022-08-15、2022-08-19、2022-08-23，样品经十堰市人民医院药检室雷龙副主任中药师鉴定为野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的花和花蕾。

方法与结果

1.样品预处理

将采集的野葛花样品放置于烘箱中50 ℃烘干，粉碎，过三号筛，备用。

2.色谱条件

色谱柱：Inertsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.1%磷酸水（15∶85），流速为1.0 ml·min-1，柱温40 ℃，检测波长265 nm，进样量为10 μl。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱法（HPLC）色谱图。A为对照品溶液，B为样品溶液，C为空白溶液；1为染料木素，2为射干苷

3.对照品溶液的制备

精密称取射干苷、染料木素对照品适量，加70%甲醇制成每含2.8 mg/L、3.3 mg/L的溶液，即得射干苷、染料木素对照品溶液。

4.供试品溶液的制备

精密称取不同采集时间的野葛花花蕾和花粉末（过三号筛）各0.5 g，置100 ml锥形瓶内，加70%甲醇50 ml，超声（250 W，40 kHz）提取30 min，称重，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

5.线性关系考察［13-14］

取射干苷、染料木素对照品5.2 mg和4.4 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加70%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，用70%甲醇逐级稀释，得射干苷、染料木素质量浓度分别为0.8、1.6、3.3、6.5、13.0、26.0、52.0 mg/L，0.7、1.4、2.8、5.5、11.0、22.0、44.0 mg/L对照品溶液，精密吸取上述配制的不同浓度对照品溶液各10 μl，注入高效液相色谱仪，测定峰面积。以质量浓度（mg/L）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，计算回归方程为Y=44 809X+568.45，r=1.000 0和Y=3 9651X+671.05，r=1.000 0，射干苷、染料木素质量浓度在0.8～52.0 mg/L和0.7～44.0 mg/L之间与峰面积线性关系良好。

6.精密度实验

精密吸取上述“3.”项下对照品溶液，按照“2.”项下色谱条件连续进样6次，依次记录峰面积。计算射干苷、染料木素含量，相对标准偏差（RSD）分别为0.96%、0.86%，表明仪器精密度良好。

7.稳定性实验

取“4.”项下同一个供试品溶液（2022-08-07野葛花花蕾）适量，于室温下放置0、2、4、6、8、10、12、24 h，分别按“2.”项下色谱条件进样，记录峰面积。计算射干苷、染料木素含量，RSD为0.80%、0.73%，表明供试品溶液在室温条件下24 h内稳定。

8.重复性实验

取同一批次药材（2022-08-07野葛花花蕾）粉末0.5 g，共6份，按照“4.”项下方法制备供试品溶液，依次按照“2.”项下色谱条件进样，记录峰面积，计算射干苷、染料木素含量，RSD为1.54%、1.79%，表明建立的方法重复性良好。

9.加样回收实验（表1）

表1 野葛花花蕾加样回收率试验结果

取同一批次已知含量的药材（2022-08-07野葛花花蕾）粉末0.25 g，精密称定，共6份，分别置于锥形瓶中，精密加入适量射干苷、染料木素对照品，按照“4.”项下方法制备供试品溶液，依次照“2.”项下色谱条件进样，记录峰面积，计算射干苷、染料木素含量，得其加样回收率为98.56%、101.08%，RSD为1.97%、1.76%，表明该方法加样回收率较好。

10.不同采收期野葛花花和花蕾中射干苷和染料木素含量比较分析（表2、图2、图3）

表2 不同采收期野葛花不同用药部位花和花蕾中射干苷、染料木素含量测定结果（mg·g-1）

图2 不同采收期野葛花不同用药部位花和花蕾中射干苷含量经时变化图

图3 不同采收期野葛花不同用药部位花和花蕾中染料木素含量经时变化图

取“4.”项下各批次野葛花花蕾和花样品的供试品溶液，分别按“2.”项下色谱条件进样，记录峰面积，计算样品中射干苷、染料木素的含量。

由表2和图2可知，不同采收期的野葛花花蕾和花样品中射干苷的含量花蕾＞花，花蕾立秋后两个星期高于立秋前（20220807立秋），花立秋时高于立秋前，之后呈下降趋势。

由表2和图3可知，不同采收时间野葛花花蕾和花样品中染料木素的含量花蕾＜花，花中染料木素的含量没有明显的变化，受采收期影响较小，而花蕾中的含量处于升高趋势。

讨 论

本实验着重考察了不同提取方法如回流提取法、超声提取法及甲醇、水、无水乙醇、10%～95%甲醇、10%～95%乙醇等不同提取溶剂对射干苷和染料木素含量的影响，根据研究结果确定以70%甲醇为溶剂、采用超声提取的方法制备相应供试品溶液，该方法操作简便、提取率高，可用于葛花中射干苷和染料木素含量的测定［15-17］。

中药材的采收时间对保护药材资源、提高产量和质量等具有关键作用［18］。由实验结果可知，不同采收期的葛花花蕾和花样品中射干苷的含量花蕾＞花，染料木素的含量花蕾＜花，因二者的含量最高点均为立秋后样品。采收时间过早或过晚均会影响有效成分的含量。因此，建议武当山产野葛花立秋后采集，此时产量亦较高［19］。此外，因葛花产地分布较广，不同地区最佳采收时间可能会发生变化，需要充分考虑到气候、生境等因素的异质性，合理制定最佳采收期［20］。

中国酒文化源远流长，但过量饮酒危害较大，易引发各种疾病［21］。葛花是中医治疗体系中最具代表性的具有解酒作用的药物。本研究通过对不同采收期野葛花药材不同用药部位（花蕾、花）中射干苷和染料木素的经时变化特征进行研究，为其开发利用以及质量标志物预测提供了数据支持［22-26］，亦为其质量标准的提高提供了基础，对保障葛花药材质量，实现产业高质量、可持续发展具有非常重要的意义［27-28］。鉴于本研究的局限性，葛花药材不同用药部位花和花蕾解酒作用强弱有待进一步药理作用研究［29-31］。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明石金敏：酝酿和设计试验，实施研究，采集数据，分析/解释数据，文章撰写，统计分析；董勇强：采集数据；周灿：分析/解释数据，起草文章，统计分析；余绪明：分析/解释数据，统计分析；柯静：分析/解释数据，对文章的知识性内容作批评性审阅；王林海：酝酿和设计试验，分析/解释数据，获取研究经费，行政、技术或材料支持，指导，支持性贡献