猪流行性腹泻病毒非结构蛋白Nsp14 真核表达载体构建及蛋白表达鉴定

武峰峰，高振秋，郑亮，3，牛欣雨，魏佳琪，吴志军，张华，曹宏伟，

（1.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319；2.盐城师范学院药学院；3.黑龙江八一农垦大学动物科技学院）

宿主的先天免疫是抵御病毒感染的第一道防线，但一些病毒已经进化出多种逃避抗病毒先天免疫的策略。猪肠道冠状病毒（PECS）包括猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪δ 冠状病毒（PDCoV）、传染性胃肠炎冠状病毒（TGEV）和猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS-CoV），可引起仔猪致死性腹泻，威胁全球养猪业。与其他冠状病毒一样，PEDV 的免疫逃逸是引起感染的关键致病机制。

PEDV 为冠状病毒科冠状病毒属成员，基因组结构包括编码S 蛋白、E 蛋白、M 蛋白和N 蛋白四个结构蛋白的基因，其余基因编码16 个非结构蛋白[1]。PEDV 可引起猪的急性和高度传染性肠道病毒病。从2010 年开始，美国和亚洲国家的PEDV 疫情显著增加，在全球范围内造成了严重的经济损失[2-3]，已确定导致这些疫情发生的是高毒力的PEDV 毒株的变种。这些PEDV 毒株的免疫逃逸与仔猪病情严重密切相关。在PEDV 感染过程中，病毒能够通过某种途径抵抗宿主的抗病毒反应，几个复制酶作为干扰素拮抗剂，阻断宿主抗病毒蛋白的表达[4]。PEDV Nsp14是一种具有鸟嘌呤N7 甲基转移酶和外切酶结构域的双功能酶[5]，N7 甲基转移酶活性对病毒基因组的翻译至关重要，能够防止宿主将病毒mRNAs 视为“非我”[6]，如果Nsp14 的N7 甲基转移酶结构域发生突变，那么PEDV 对宿主的天然免疫反应将会变得更加敏感。而Nsp14 的外切酶活性在抵抗病毒天然免疫反应的过程中也发挥着重要作用[6]。一项研究表明，N7 甲基转移酶缺陷的PEDV 在复制方面存在缺陷，但感染该病毒会导致Ⅰ型和Ⅲ型IFN 分泌增加[7]。对冠状病毒Nsp14 的研究已经逐渐深入，然而PEDV Nsp14 仍有许多功能有待进一步探究。

所以，研究拟利用RT-PCR 的方法从病变猪小肠中扩增出PEDV Nsp14 基因，并将该基因与真核表达载体PRK5-Myc 相融合后转染真核细胞，观察重组表达载体PRK5-Myc-Nsp14 的表达情况。试验结果显示，研究成功构建PEDV Nsp14 基因的重组表达载体PRK5-Myc-Nsp14，并用Western Blot 技术验证PRK5-Myc-Nsp14 重组载体成功在真核细胞中表达，为以后深入探索PEDV Nsp14 蛋白的功能奠定了一定的基础。

1 材料和方法

1.1 试剂

HeLa 细胞和IPEC J2 细胞均保存于生物中心509 试验室液氮罐中；小鼠抗Myc 单克隆抗体（mAb）、小鼠抗β-actin 单抗（mAb）以及山羊抗小鼠辣根酶标记IgG、FITC 标记的山羊抗小鼠IgG 均购自北京中衫金桥生物技术公司；DEME 培养基和胎牛血清（fetal cattle serum，FBS）、Lipofectamine TM 2 000 购自英潍捷基（Invitrogen）上海贸易有限公司；DNA 胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购于Omega 公司；MLV 逆转录酶，PCR 试剂盒、限制性内切酶、T4连接酶、M-MLV 反转录酶、Ex Taq 热启动DNA 聚合酶购自TaKaRa 公司；引物合成和序列测定由擎科生物（北京）公司完成；感受态细胞DH5α 购自北京天根公司；PRK5-Myc 载体由实验室保存。

1.2 引物设计及表达载体构建路线

根据已发表在GenBank 网站中PEDV USA/KS/2013 毒株（KJ184549.1）基因序列，设计具有特异性的PEDV Nsp14 基因上游及下游引物，上游引物：5’-AAGCCTGACATTGACATTG-3’（EcoRⅠ）和下游引物：5’-TGCCGAACCTATCATTGA-3’（HindⅢ）。将PEDV Nsp14 基因插入PRK5-Myc 的EcoRⅠ/HindⅢ位点之间。构建以Myc 为标签的Nsp14 蛋白融合表达载体。

1.3 扩增PEDV Nsp14 基因

取部分病变的猪小肠组织于研钵中，加入液氮并迅速研磨，将研磨成粉末状的组织分装于1.5 mL离心管中，加入1 mL Trizol 溶液后剧烈摇晃60 s，静置10 min 后加入200 μL 在4 ℃冰箱中预冷的三氯甲烷溶液并迅速摇晃20 s，静置15 min 后在4 ℃低温离心机中离心15 min，离心力10 000×g。将离心结束后的上清液转移到新的离心管中并向其中加入600 μL 异丙醇溶液，轻摇混匀后静置10 min。静置完毕在4 ℃低温离心机中离心10 min，离心力为10 000×g。离心结束后弃掉上清，并向其中加入600 μL用DEPC 水配制的浓度为75%的乙醇，静置10 min后在4 ℃低温离心机中离心10 min，离心力为10 000×g。离心结束后弃上清，静置5 min 后加入20 μL 的DEPC 水静止15 min，测量RNA 浓度后保存于-80 ℃冰箱中。

取1 000 ngRNA 于PCR 管中，加入1 μL oliga（dT）并补加DEPC 水至6 μL，放入PCR 仪70 ℃持续10 min。10 min 后再加入2 μL buffer，2 μL dNTP，0.25 μL RRI，0.1 μL M-MLV，5.65 μL DEPC 水，放入PCR 仪30 ℃10 min；42 ℃1 h，80 ℃10 min。反转录结束获得PEDV Nsp14 基因的cDNA，测量DNA浓度后保存于-20 ℃冰箱中。

取500 ng 上一步得到的cDNA 于PCR 管中，加入4 μL dNTP Mixture，5.0 μL 10×PCR Buffer，0.4 μL上游引物、0.4 μL 下游引物、0.25 μL Taq 酶，最后加入dd H2O 至总体积为50 μL，放入PCR 仪94 ℃预变性10 min；94 ℃变性45 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，循环35 次。最后一个循环72 ℃，延伸10 min，获得PEDV Nsp14 基因片段。

1.4 PEDV Nsp14 基因真核表达载体的构建及鉴定

将PEDV Nsp14 基因片段和PRK5-Myc 载体均使用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，试验条件为37 ℃，酶切2 h，酶切完毕后将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳并利用Omega DNA 胶回收试剂盒回收酶切产物。

向上述两种回收产物中加入T4 连接酶、buffer和去离子水，置于16 ℃连接仪，连接反应持续12 h。连接产物用DH5α 感受态细胞转化，并于固体LB 培养基上过夜培养。从过夜培养的固体LB 培养基上挑取单菌落于液体LB 培养基上扩大培养，并使用Omega 质粒小提试剂盒提取质粒，将所提质粒进行PCR 鉴定和双酶切鉴定，筛选正确的质粒，保存于-20 ℃冰箱中。并从中取10 μL 质粒送至公司进行测序，重组质粒命名为PRK5-Myc-Nsp14。

1.5 转染细胞及Western Blot 检测

将Hela 细胞和IPEC J2 细胞接种至24 孔板内，当其细胞密度达到80%左右时进行转染。用脂质体Lipofectin2 000 将质粒送入细胞，转染完成后继续培养24 h。24 h 后弃掉培养液，沿壁轻柔加入PBS 缓冲液清洗2~3 次，加入RIPA 裂解液30 μL，冰浴裂解30 min。裂解完毕，刮下细胞置于1.5 mL 离心管中，在4 ℃低温离心机中离心10 min，离心力为12 000×g，收集上清液，加入5×Loading Buffer，在沸水中煮10 min。得到处理好的蛋白样品，将所得蛋白样品进行SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳完毕后将目的条带经湿转转至PVDF 膜上，用5%脱脂奶粉封闭2 h后，用TBST 洗膜8 次，每次15 min，用小鼠抗Myc单克隆抗体（1∶3 000）在4 ℃低温摇床中孵育过夜，用TBST 洗膜8 次，每次15 min，再与辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶3 000）摇床孵育2 h，经TBST 洗膜，利用特超敏ECL 化学发光试剂盒在化学发光成像系统中成像并记录试验结果。

1.6 间接免疫荧光

向24 孔板中放入爬片，将Hela 细胞和IPEC-J2细胞接种至24 孔板内，待细胞密度达到60%左右时，用Lipofectin2 000 将PRK5-Myc 和PRK5-Myc-Nsp14 质粒转染至IPEC-J2 和Hela 细胞中，4~6 h 后更换含有10%胎牛血清的DMEM。在37 ℃，5%的CO2培养箱中培养24 h，24 h 后弃掉培养液，沿壁轻柔加入4 ℃预冷的PBS 缓冲液清洗2~3 次，每孔加入500 μL 的4%的多聚甲醛，室温条件下固定20 min；再用4 ℃预冷的PBS 缓冲液清洗细胞2~3 次，每次清洗5 min。然后加入0.1%的Triton X-100，室温条件下透膜20 min；用4 ℃预冷的PBS 缓冲液清洗细胞2~3 次，每次5 min；加入5% BSA 封闭2 h，加入一抗孵育1 h；PBS 清洗3 次，每次清洗5 min；加入荧光素标记的二抗（1∶3 000），在室温条件下避光孵育2 h；PBS 清洗3 次，每次5 min。最后取干净且灭菌后的载玻片，滴加少量DAPI 染料，用针头挑出爬片，让带有细胞的面朝下扣在载玻片上，用吸水纸吸掉多余液体，用橡皮轻轻压紧，再将指甲油均匀涂抹在爬片周围，避光晾干，待片子干燥后用荧光显微镜观察拍照，并保存图片。

2 结果与分析

2.1 PEDV Nsp14 基因片段的PCR 扩增

取病变猪小肠组织于研钵中，加入液氮研磨成粉末后，用Trizol 试剂提取组织总RNA，以提取出的总RNA 为模板，反转录得到cDNA，接下来以cDNA为模板进行PCR 扩增，得到片段大小为1 551 bp 的目的条带，即为特异的PEDV Nsp14 基因片段，结果如图1。

图1 Nsp14 基因片段的PCR 扩增Fig.1 PCR amplification of Nsp14 gene fragment

2.2 PEDV Nsp14 及真核表达载体PRK5-Myc 的双酶切

将PCR 扩增后的目的基因与真核表达载体PRK5-Myc 连接之前，用EcoRⅠ和HindⅢ核酸内切酶将目的基因和载体进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2。

图2 PEDV Nsp14 基因和真核表达载体PRK5-Myc 的双酶切Fig.2 Double restriction digestion of PEDV Nsp14 gene and eukaryotic expression vector PRK5-Myc

2.3 重组质粒PRK5-Myc-Nsp14 的PCR 鉴定

利用T4 连接酶将酶切产物进行连接，连接产物转化及提取质粒后得到重组质粒PRK5-Myc-Nsp14。用常规方法进行PCR 鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果显示在1 551 bp 附近有单一明亮目的条带，符合理论设计结果，结果如图3。

图3 重组质粒PRK5-Myc -Nsp14 的PCR 鉴定Fig.3 Identification of recombinant plasmid PRK5-Myc -Nsp14 using PCR

2.4 重组质粒PRK5-Myc-Nsp14 双酶切鉴定

经PCR 初步鉴定后，取1 000 ng 结果为阳性的质粒，加入EcoRⅠ和HindⅢ两种酶置于37 ℃水浴锅中对重组质粒进行双酶切鉴定，结果得到片段大小约为1 551 bp 和4 720 bp 的两条目的条带，得到结果与预期理论设计结果相符，结果如图4。

图4 重组质粒PRK5-Myc-Nsp14 的双酶切分析Fig.4 Double enzyme digestion analysis of recombinant plasmid PRK5-Myc-Nsp14

2.5 重组表达载体序列比对

取10 μL PRK5-Myc-Nsp 14 质粒送至北京生物公司进行测序，将测序结果与PEDV USA/KS/2013 毒株（KJ184549.1）序列进行多序列比对，结果显示其同源性高达99%，结果如图5。

图5 PRK5-Myc-Nsp14 与USA/KS/2013 毒株（KJ184549.1）序列比对Fig.5 Sequence alignment between PRK5-Myc-Nsp14 and USA/KS/2013（KJ184549.1）strains

2.6 Western Blot 检测细胞中表达的重组蛋白

处理好的蛋白样品经SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将目的蛋白湿转至PVDF 膜，转膜完毕，先用5%脱脂奶粉封闭2 h，然后分别用鼠抗Myc 单抗及山羊抗小鼠二抗（1∶3 000）孵育，检测载体PRK5-Myc 及重组表达载体PRK5-Myc-Nsp14 的表达情况，其结果显示为图6。

图6 Western Blot 鉴定蛋白融合表达Fig.6 Identification of protein fusion expression by western Blot

2.7 Nsp14 蛋白在细胞中的表达

利用荧光显微镜观察PRK5-Myc-Nsp14 在Hela细胞和IPEC-J2 细胞中红色荧光的分布情况，以此用来确定重组表达载体PRK5-Myc-Nsp14 在细胞中的表达以及定位的情况。结果显示重组表达载体PRK5-Myc-Nsp14 质粒成功表达，并且在细胞核和细胞质内均有分布，结果如图7。

图7 Nsp14 蛋白在Hela 细胞和IPEC-J2 细胞中的表达Fig.7 Expression of Nsp14 protein in Hela cells and IPEC-J2 cells

3 讨论

2010 年以来，PEDV 变异株逐渐席卷全球养猪业，带来了巨大的经济损失。病毒如此巨大的危害与其强大的传播性分不开。一般来说，PEDV 的主要传播途径是粪口传播，但在猪与猪以及农场与农场之间可能通过粪便到鼻腔的途径进行空气传播[8]。PEDV 主要感染猪肠上皮细胞，然后定植于肠道，导致肠道绒毛萎缩、坏死和脱落，影响营养物质的吸收，引起猪呕吐、腹泻、体重减轻、食欲不振和抑郁[9-10]。当PEDV 进入到粪便中时，受污染的粪便可能会导致大规模疫情。保护新生哺乳仔猪免受PEDV 感染最有效的策略是从初乳和乳汁中获得足够的母体抗体[11]。虽然PEDV 灭活疫苗、弱毒疫苗已经开始广泛使用，但各国猪场感染率仍然非常高[12]。因此，迫切需要对该病及其病原体进行深入研究，并迅速开发基于流行毒株的有效疫苗。

有关PEDV 各方面的研究已经展开，例如在PEDV 引起细胞自噬方面[13]，在PEDV 抗原表位鉴定方面等[14]。有报告指出Nsp14 是一种双功能蛋白，它除了具有核酸外切酶活性外，在其C 末端结构域还具有鸟嘌呤N7 甲基转移酶活性，属于核酸外切酶超家族DEDD，Nsp14 还包括许多DNA 聚合酶以及其他真核和原核外核酸酶的校对结构域[15]。N7 甲基鸟苷帽是真核生物mRNA 的一个明显的结构特征，包括那些在细胞质中复制的真核生物病毒。Nsp14 能够催化核苷单磷酸沿3’-5’方向切除[16]。这种核酸外切酶活性对于冠状病毒复制过程中的校对活性至关重要。Nsp14 包含三个外显子保守基序，在三个外显子保守基序中含有四个关键的金属配位氨基酸。金属离子Mg2+或Mn2+对Nsp14 核酸外切酶活性至关重要[16]。不同部位的基序发生突变会导致突变率增加，对致死性突变和IFN-β 更敏感，感染峰值滴度降低等影响[16-19]。

一些研究表明，冠状病毒nsp10 是Nsp14 外切酶活性的刺激因子，使其核酸外切酶活性增加[16-17]。破坏nsp10 和Nsp14 之间的相互作用或Nsp14 外切酶活性失活会降低复制的保真度，并加速致死突变的产生[18，20-21]。虽然基本的Nsp14 外切酶活性不需要辅因子的存在，但它的活性只有在nsp10 蛋白存在的情况下才被完全激活[17]。Nsp14 核酸外切酶还参与了病毒生命周期的其他过程，包括对病毒基因组重组的调控[22]和干扰宿主的先天性免疫反应[6]。此外，Nsp14外切酶活性可能使冠状病毒对核苷类似物（NA）药物[20，23-25]产生特异性耐药性，这对以nsp12（RNA 依赖RNA 聚合酶）为靶标的核苷抑制剂的开发构成了巨大的挑战。因此，研究Nsp14 的功能对了解病毒免疫逃逸的机制等其他方面具有重要作用。

试验使用Trizol 法从病变猪小肠中提取总RNA，并通过PCR 技术获得PEDV Nsp14 基因，将基因和空载体同时双酶切后用T4 连接酶连接，连接产物在固体LB 培养基上转化，10 h 后将部分单菌落在液体LB 中扩大培养并提取质粒，经过PCR 检测和双酶切检测鉴定重组质粒，在真核细胞中检测表达情况和细胞定位情况。试验为后续对Nsp14 蛋白功能的探索奠定了基础。