非小细胞肺癌A549细胞培养上清液中外泌体的分离提取及鉴定

郑巧鑫，苏欣，魏淑贞，刘诗怡，罗晶，黄颖，苏会岚，李娜

成都医学院公共卫生学院，四川成都 610500

细胞外小囊泡（extracellular vesicles，EVs）包括外泌体、微囊泡和其他囊泡。外泌体直径为30～150 nm，含有核酸和蛋白质［1-3］。有研究发现，大多数细胞均能产生外泌体［4-6］，其广泛存在于各种体液和细胞培养液中［7］。外泌体的功能取决于其来源细胞的类型，因此可用于追溯其母体来源［8］。多项研究表明，肿瘤来源的外泌体参与肿瘤细胞和基底细胞之间的遗传信息传递，促进大量新血管生成，影响肿瘤的生长、侵袭、扩散、耐药性和免疫监视［9-14］；外泌体还可作为诊断生物标志物及药物的输送载体［15-16］。因此，检测血液中不同肿瘤细胞外泌体对肿瘤诊断具有重要意义［17］。

肺癌是全球发病率及死亡率最高的恶性肿瘤之一，目前，临床现有筛检手段（胸部X 片、螺旋CT、支气管内镜、痰细胞学等）的敏感性、特异性和适用性有限，难以实现早期诊断。外泌体来自于多泡体释放的循环囊泡，参与肿瘤细胞多种生物学功能［18］，是细胞间信息传递的重要媒介，有望成为新一代的新兴生物标志物［19］，探讨其在肿瘤发生和发展中的内在机制，可为肺癌的早期有效诊断和治疗提供新思路［20］，而外泌体的分离提取技术成为其相关研究的关键步骤［21］。目前，有多种方法分离EVs，获得不同浓度和纯度的外泌体［22］，如超速离心法（ultracentrifugation，Ult）、密度梯度离心法和免疫磁珠法［23-25］。但这些方法耗时耗力，分离效率较低［26］，对外泌体损伤较大［27］，纯度低且易存在蛋白质污染［28］，不能满足相关研究和应用的需要。Exo QuickTM是快速分离提取外泌体的试剂盒，该方法简便、快速、可靠，但其成本较高，外泌体获得率有限［29］。因此，本研究将Exo QuickTM与Ult结合，建立改良法（Ult-Exo QuickTM，U-EQ），用该方法分离非小细胞肺癌A549 细胞外泌体，并进行纯化及生物学鉴定，以期提高外泌体获得率，为实现以外泌体为标志物进行肿瘤早期诊断奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞 非小细胞肺癌A549细胞购自ATCC。

1.2 主要试剂及仪器 胎牛血清、RPMI1640培养基及青-链霉素均购自美国Gibco公司；Exo QuickTM试剂盒购自上海Umibio 公司；DiI染色工作液购自上海Yeasen Biotech 公司；增强BCA 蛋白检测试剂盒、兔抗CD63单克隆抗体、兔抗HSP70 多克隆抗体及HRP 酶标记的羊抗兔IgG 均购自上海Beyotime Biotechnology公司；纳米粒子追踪分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）系统购自成都测试狗科研服务有限公司公司。

1.3 细胞培养 将A549 细胞用RPMI1640 完全培养基（含10%胎牛血清及1%青-链霉素）于37 ℃培养48 h，细胞覆盖率达50%～60%，弃培养基，PBS 洗涤2 次，更换为无血清RPMI1640 培养基，继续培养48 h，收集细胞上清液。

1.4 外泌体的分离提取 将A549 细胞培养上清于4 ℃，300×g离心10 min；取上清液，于4 ℃，2 000×g离心10 min；取上清，于4 ℃，12 000×g离心10 min；取上清，按1∶4 的体积分数加入Exo QuickTM试剂盒中的外泌体浓缩液（exosome concentration solution，ECS），4 ℃放置3 h；于4 ℃，10 000×g离心60 min；取沉淀，用PBS重悬，于4 ℃，12 000×g离心2 min；取上清，加至Exo QuickTM试剂盒中的外泌体纯化柱（exosome purification filter，EPF）的上腔，于4 ℃，3 000×g离心10 min，收集EPF 柱底部的液体，即纯化外泌体。将纯化外泌体于4 ℃，12 000 ×g离心至液体体积为初始体积的1/5，收集外泌体溶液，按50µL/瓶分装，-80 ℃保存。同时采用传统方法，即Ult 法提取A549 细胞外泌体［30］。

1.5 外泌体的鉴定

1.5.1 蛋白浓度 采用增强BCA 蛋白检测试剂盒检测外泌体的蛋白浓度。

1.5.2 粒径分布 用1 × PBS 将100 µL 外泌体重悬至1 mL，NTA 分析外泌体的布朗运动轨迹并测定外泌体的浓度和粒径大小。

1.5.3 形态观察

1.5.3.1 荧光染色 取10µL外泌体，加入1mL5µmol/L的DiI染色工作液，37 ℃孵育30 min；1 340×g离心5 min，弃上清液，用37 ℃预热的培养基重悬沉淀，重复离心3 次，取沉淀，PBS 重悬，置倒置荧光显微镜下观察，并拍照。

1.5.3.2 透射电镜（transmission electron microscope，TEM） 将外泌体用1×PBS稀释100倍后，按2 mL分装至EP 管中，送成都测试狗科研服务有限公司进行TEM拍摄。

1.5.4 CD63和HSP70蛋白表达的检测 采用Western blot 法。BCA 法检测外泌体浓度，经7%～15% SDSPAGE 分离后，转移至PVDF 膜，用5%脱脂奶粉于室温封闭1 h；分别加入兔抗CD63 单克隆抗体及兔抗HSP70 多克隆抗体（均1∶1 500 稀释），于4 ℃孵育24 h；用TBST 洗涤3 次，加入HRP 标记的羊抗兔IgG（1∶2 000 稀释），于室温作用1 h；ECL法显色。

1.6 数据采集及分析 应用Excel 2016 软件进行数据采集分析及作图。

2 结果

2.1 外泌体的蛋白浓度 U-EQ 和Ult 法分离提取外泌体的蛋白浓度分别为1.355和0.909 mg/mL，U-EQ分离提取外泌体的蛋白浓度大幅提高。

2.2 外泌体的粒径分布 U-EQ 和Ult 法提取外泌体的颗粒总数分别为4.65×109和4.06×109粒/mL，峰值尺寸分布范围分别为81.5～165.5 和59.5～176.5 nm，平均尺寸分别为（152.3±8.8）和（94.3±9.8）nm。见图1 和图2。表明U-EQ 法提取的外泌体大小分布更均匀，颗粒浓度更高。

图1 A549细胞外泌体的粒径分布图Fig.1 Particle size distribution of A549 cell exosomes

图2 A549细胞外泌体的布朗运动视频截图（×20）Fig.2 Screenshot of Brownian motion video of A549 cell exosomes（×20）

2.3 外泌体的形态

2.3.1 荧光染色 镜下观察可见，两种方法分离提取A549 细胞培养上清中外泌体的形态均为微小囊泡，直径为30～150 nm，但U-EQ 法分离提取的外泌体形态均一，Ult 法分离提取的外泌体粒径差异较大。见图3。

图3 A549细胞外泌体的荧光显微镜下观察（×50）Fig.3 FluorescencemicroscopyofA549cellexosomes（×50）

2.3.2 透射电镜 两种方法分离提取的外泌体均为微囊泡，直径范围为30～150 nm，但U-EQ 法分离提取的外泌体粒径较均一，Ult 法分离提取的外泌体大小相差较大。见图4。

图4 A549细胞外泌体的TEM照片（×200）Fig.4 TEM photography of A549 cell exosomes（×200）

2.4 外泌体表面CD63和HSP70蛋白的表达情况 两种方法分离提取的外泌体中均可见CD63 和HSP70蛋白表达，相对分子质量分别为56 000 和70 000，U-EQ法分离提取的外泌体蛋白表达量更高，见图5。

3 讨论

目前，由于缺乏外泌体标准化的分离和纯化方法，使实验室间相关性较差，难以进行深入研究。传统技术，如Ult法、密度梯度离心法和免疫磁珠法，存在纯度低、操作困难或外泌体团聚的问题，限制了外泌体相关研究的进展。因此，从各种不同肿瘤中简单快速分离提取外泌体成为亟需解决的问题。

采用Exo QuickTM试剂盒分离提取外泌体应用广泛［31］，但试剂盒成本较高，本研究在此基础上结合外泌体分离的黄金标准Ult法建立改良法（U-EQ法），从A549 细胞培养上清液中分离纯化外泌体，该方法分离提取外泌体的产量高，耗时较短，浓度可达1.355 mg/mL，颗粒浓度达4.65 × 109粒/mL，而Ult法分离提取的外泌体浓度为0.909 mg/mL，颗粒浓度为4.06×109粒/mL。经TEM、NTA、荧光染色分析，改良法分离提取的外泌体纯度及浓度均高于传统方法。

外泌体鉴定是分离提取的关键步骤。外泌体中含有多种生物分子，如各种蛋白质、DNA、mRNA、非编码RNA 和脂质。外泌体蛋白参与外泌体抗原递呈及内吞转运等相关生命活动，维持外泌体骨架结构。外泌体中普遍存在的蛋白，如4次跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81 及CD82）、热休克蛋白（HSP60、HSP70 及HSP90）等是外泌体提取鉴定中的重要指标，是外泌体的特异性标志性蛋白［32］。HSP70 是肿瘤细胞膜锚定蛋白，在肿瘤细胞中异常高表达，而正常细胞表达水平较低，受细胞周期的严格调控［33］。采用Western blot法对外泌体表面标志性蛋白CD63及HSP70表达水平进行检测，从蛋白层面对外泌体进行鉴定，结果表明，U-EQ法分离提取的外泌体表面CD63及HSP70蛋白表达量更高。

综述所述，U-EQ 法可获得足够数量的A549 细胞外泌体，且浓度更高、粒径更均一，为以外泌体为标志物进行肿瘤早期诊断奠定了基础。