MAPK通路在红托竹荪多糖诱导人胃癌MKN-45细胞凋亡中的作用机制研究Δ

杨 茜,卢海洋,胡 露,2,王忠元

(1.贵州省人民医院药剂科,贵阳 550002; 2.贵州医科大学药学院,贵阳 550025)

胃癌的发病率在我国恶性肿瘤中仅次于肺癌[1];西北地区、东部沿海以及东北地区的发病率明显高于南方地区[2-4]。红托竹荪是一种营养丰富、味道鲜美的药食两用真菌,从竹荪中提取得到的竹荪多糖是其主要药用成分,已被证明具有免疫调节功能,且对肝癌等肿瘤细胞具有直接抑制与促凋亡作用[5-9]。丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信号通路是参与肿瘤细胞增殖、分化、凋亡的重要信号转导通路。目前尚无关于红托竹荪多糖对肿瘤细胞MAPK通路影响的文献报道。本研究旨在研究红托竹荪多糖对胃癌MKN-45细胞的影响,并探讨红托竹荪多糖对MAPK信号通路的调控作用,为红托竹荪多糖的进一步开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株:人胃癌细胞株MKN-45,购自易泽生物科技(上海)有限公司。

1.1.2 仪器:3111型二氧化碳培养箱(美国Thermo Fisher公司);全波长EPOCH2型酶标仪(美国BioTek公司);CKX41型倒置荧光显微镜(日本Olympus公司);FC500型流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司);MICROCL17型水平摇床(江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司)。

1.1.3 药品与试剂:红托竹荪多糖,纯度≥98%,购自陕西慈缘生物技术有限公司,批号为CY210304;RPMI1640培养基、胎牛血清均购自美国Gibco公司,批号为11995065、10099141;细胞计数法-8(CCK-8)试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司,批号为E606335-0500;膜联蛋白V(Annexin V)-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)细胞凋亡检测试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司,批号为40302ES20;PI染色试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司,批号为E607306;二辛可宁酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司,批号为P0010;兔抗p38蛋白激酶(p38)、磷酸化p38蛋白激酶(p-p38)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)、磷酸化细胞外调节蛋白激酶(p-ERK)、c-Jun 氨基末端激酶(JNK)、磷酸化JNK(p-JNK)单克隆单体和鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体均购自美国CST公司,批号为8690S、4631S、4695S、4370S、9252S、4671S和5174;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)抗体购自美国Proteintech公司,批号为19677-1-AP;B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)抗体购自美国Millipore公司,批号为ab1722。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:人胃癌MKN-45细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养,置于37 ℃、5%CO2的培养箱内,每2～3 d更换1次培养液,细胞密度达到80%～90%时,用0.25%胰蛋白酶消化后传代,取对数生长期的细胞用于实验[10]。

1.2.2 分组与给药:细胞以2×104个/孔的密度接种于细胞板后,将细胞分为低、中及高剂量组(实验组)和对照组,实验组加入不同浓度的红托竹荪多糖,其终浓度分别为4、6及8 mg/mL;对照组给予等量磷酸盐缓冲溶液(PBS)处理。每组设4个复孔,置于CO2培养箱中共同培养48 h。用倒置显微镜观察细胞生长状态并采集图像。

1.2.3 CCK-8法检测细胞毒性:更换96孔板中的培养液,同时每孔加入CCK-8试剂10 μL;在37 ℃细胞培养箱中避光孵育1 h;用酶标仪检测450 nm处的吸光度OD值。细胞增殖抑制率(%)=(对照组OD值-实验组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%[11]。

1.2.4 AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率:将细胞分为PBS对照组与实验组,实验组的红托竹荪多糖终浓度为8 mg/mL,细胞以2×105个/mL密度接种于6孔板中,培养48 h后用不含乙二胺四乙酸的胰酶消化、预冷PBS洗涤,1 500 r/min,离心半径12 cm,4 ℃离心5 min弃去上清液,重复2次后收集MKN-45细胞的细胞悬液,将细胞密度调整为1×106个/mL。取100 μL细胞悬液于5 mL流式管中,加入Annexin- FITC溶液5 μL和20 μg/mL的PI 10 μL,轻轻混匀。避光、室温(25 ℃)反应15 min。加入Annexin-FITC缓冲液400 μL,混匀,于1 h内采用流式细胞仪检测[12]。

A.对照组;B.实验组。

A.对照组;B.实验组。

1.2.5 流式细胞术检测细胞周期分布:分组及加药处理同“1.2.4”项。用PBS洗涤细胞后收集沉淀,75%乙醇固定过夜,去除乙醇后清洗、重悬细胞,加入10 mg/mL的核糖核酸酶A溶液2.5 μL,37 ℃孵育30 min,加入50 μg/mL的PI 50 μL混匀,用流式细胞仪检测,软件分析细胞周期分布。

1.2.6 蛋白质印迹法检测MKN-45细胞p38、p-p38、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK、cleaved Caspase-3和Bcl-2的表达:分组及加药处理同“1.2.4”项。在培养48 h后收集各组细胞1×106个,RIPA法提取细胞总蛋白,BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。将提取的蛋白上清液与5×蛋白上样缓冲液,放入沸水中进行沸水浴10 min使蛋白变性。制备分离胶,取待测蛋白40 μg,行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,电转移至PVDF膜,用含5%脱脂奶粉的TBST(封闭液)浸泡PVDF膜,室温摇床封闭30 min,用一抗稀释液稀释相应的一抗(p38、p-p38、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK、Caspase-3一抗以1∶1 000稀释,Bcl-2一抗以1∶2 000稀释),使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中,4 ℃孵育过夜。充分洗涤PVDF膜5～6次,每次5 min。用TBST稀释相应的HRP标记二抗(1∶5 000稀释),使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中,37 ℃摇床孵育2 h后再洗去多余二抗。洗膜后用显色剂化学发光试剂显色、曝光。以GAPDH为内参,通过图像分析软件定量分析特定条带的灰度[13]。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 红托竹荪多糖对MKN-45细胞增殖的影响

4、6及8 mg/mL红托竹荪多糖分别作用于MKN-45细胞48 h后,与对照组相比,MKN-45细胞的增殖受到抑制,且随着浓度的增加,抑制作用明显增加;红托竹荪多糖低、中及高剂量组的细胞增殖抑制率进行两两比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 不同浓度的红托竹荪多糖对人胃癌MKN-45细胞增殖抑制率比较

2.2 红托竹荪多糖对MKN-45细胞形态的影响

显微镜下放大100倍观察显示,红托竹荪多糖作用于MKN-45细胞48 h后,对照组细胞形态饱满、成团生长,状态良好。与对照组比较,实验组的细胞密度减小,细胞裂解,形态不规则,出现大量死细胞,见图1。

2.3 红托竹荪多糖对MKN-45细胞凋亡的影响

Annexin V-FITC/PI双染法检测显示,红托竹荪多糖作用于MKN-45细胞48 h后,与对照组相比,实验组MKN-45细胞凋亡率明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),见表2、图2。

表2 红托竹荪多糖对MKN-45细胞凋亡的影响

2.4 红托竹荪多糖对MKN-45细胞周期的影响

流式细胞仪检测发现,红托竹荪多糖作用于MKN-45细胞48 h后,与对照组相比,实验组G1期细胞比例明显减少,G2期细胞比例明显增高,S期细胞比例明显减少,差异均有统计学意义(P<0.05),见表3、图3。

表3 红托竹荪多糖对MKN-45细胞周期的影响

2.5 红托竹荪多糖对凋亡相关蛋白及MAPK信号通路蛋白表达的影响

以Image J软件对蛋白质印迹结果作灰度分析,发现与对照组比较,实验组处理MKN-45细胞后,p-P38/P38比值、p-ERK/ERK比值与p-JNK/JNK比值均明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与对照组比较,实验组MKN-45细胞中Bcl-2的表达降低,Caspase-3的表达升高,差异均有统计学意义(P<0.05),见表4、图4。

表4 红托竹荪多糖对MKN-45细胞相关蛋白相对表达水平比较

3 讨论

胃癌是我国高发的恶性肿瘤之一,其发生与饮食有很大关联[14]。在胃癌的治疗中,许多药食同源的中药起到了非常重要的作用。从食用菌竹荪中提取的竹荪提取物已被证实对肿瘤细胞有直接的细胞毒活性,也可通过提高宿主的免疫功能而发挥间接抗肿瘤作用[15-16]。天然竹荪包括有长裙竹荪、短裙竹荪、棘托竹荪和红托竹荪等,其中红托竹荪是竹荪中具有代表性的品种之一。竹荪多糖是竹荪提取物发挥生物效应的主要成分,本研究将红托竹荪多糖作为研究对象。

初步研究结果表明,竹荪多糖诱导人肝癌HCC-LM3细胞凋亡的机制在于使细胞周期的G2/M期停滞生长,凋亡因子Bax、Caspase-3表达增加,Bcl-2/Bax比值降低[17]。另有研究结果表明,竹荪多糖DP15可通过上调路易斯肺癌细胞系LLC荷瘤小鼠脾脏髓源抑制性细胞MDSCs中的P53基因表达,下调Bcl-2基因表达,诱导荷瘤MDSCs凋亡而降低MDSCs细胞中细胞亚群CD11b+、GR1+的细胞比例,抑制小鼠体内LLC的肿瘤生长[18]。有学者同时研究了竹荪多糖对肝癌HepG2细胞、乳腺癌MCF-7细胞、宫颈癌HeLa细胞、胃癌MGC803细胞以及结肠癌LoVo细胞共5种肿瘤细胞体外的增殖抑制作用,结果表明,竹荪多糖在体外可抑制肝癌HepG2细胞、胃癌MGC803细胞和结肠癌LoVo细胞的增殖,其中对肝癌HepG2细胞的抑制作用最好,在检测浓度范围内抑制率可>50%,对结肠癌以及胃癌细胞的增殖有抑制作用,在检测浓度范围内抑制率可>20%,并具有时间及药物浓度依赖性[19]。

MAPK作为经典的信号通路,在多种肿瘤细胞的增殖、分化和凋亡过程中具有重要的作用,p38、JNK和ERK是MAPK信号通路的主要分支路线。在某些因素的刺激下,存在于细胞质的p38、JNK和ERK活化后进入细胞核内,使转录因子磷酸化,调控相关基因的表达,影响细胞周期和Fas、Bax和Cleaved Caspase-3等凋亡相关蛋白的表达,从而影响细胞的增殖与凋亡。MAPK通路被认为是肿瘤治疗的潜在作用靶点,通路被抑制时肿瘤细胞的生长也会受到抑制[20]。

本研究结果表明,红托竹荪多糖可抑制人胃癌MKN-45细胞增殖,并呈浓度依赖性,与其诱导人胃癌MKN-45细胞凋亡、使肿瘤细胞生长阻滞在G2/M期有关。进一步的机制研究结果表明,红托竹荪多糖通过调控MAPK信号通路,下调信号通路关键蛋白p-p38、p-ERK和p-JNK的表达,降低p38、ERK和JNK的磷酸化水平,使p-p38、p-ERK和p-JNK去磷酸化增强,MAPK信号通路的活化受到抑制,从而引起促凋亡蛋白cleaved Caspase-3表达增加,癌基因Bcl-2表达减弱,最终诱导MKN-45细胞凋亡。由此表明,红托竹荪多糖能通过诱导肿瘤细胞凋亡,使肿瘤细胞阻滞在G2/M,从而抑制人胃癌MKN-45细胞增殖,影响MAPK信号通路,调控MKN-45细胞凋亡。

本研究结果为红托竹荪多糖成为胃癌治疗的潜在药物提供了参考依据,为未来申报抗肿瘤新药奠定了药理学基础,为中药、民族药的资源利用发展提供了良好的思路与方向。但对于红托竹荪多糖抗胃癌细胞增殖及调控MAPK信号通路的研究目前只处于体外实验阶段,仍需进一步的动物实验来验证红托竹荪多糖是否具有体内抗肿瘤作用并阐明相关的抗肿瘤作用机制。