张爱英 崔云 刘艳 鹿秀海
牙龈二氧化碳噬纤维菌(Capnocytophaga gingivalis)属于二氧化碳噬纤维菌属黄杆菌科,该菌属目前还包括狗咬二氧化碳噬纤维菌、犬吠二氧化碳噬纤维菌、生痰二氧化碳噬纤维菌等,均为兼性厌氧、无动力的革兰阴性杆菌,但有滑行运动能力[1]。其中狗咬二氧化碳噬纤维菌和犬吠二氧化碳噬纤维菌被认为来源于动物,其他为人类口腔正常菌群[2]。该类细菌感染率约为0.000 67%,已被报道可引起脓毒症及其他内源性感染,包括心内膜炎、子宫内膜炎、骨髓炎、软组织感染、腹膜炎、眼部病变(眼内炎、眼眶蜂窝织炎等)以及坏疽性口炎[3-6]。目前对牙龈二氧化碳噬纤维菌的报道较少,国内未见对该菌引起角膜感染性疾病的相关报道,且该菌鉴定困难,目前只有16S rRNA 可作为准确鉴定结果[7]。本研究分析1 例牙龈二氧化碳噬纤维菌感染角膜溃疡患者的临床资料,结合在该菌株分离、鉴定、药敏试验和治疗过程中发现的问题进行总结,以期对该菌所致感染的诊疗提供参考,现报告如下。
1.1 患者临床资料 患者为65 岁女性,以“左眼红痛伴视力下降2 月”入院。左眼视力HM 30 cm,眼压16 mmHg(1 mmHg≈0.133 kPa),角膜中央可见灰白色溃疡灶,直径约10 mm,下方浸润明显,周围角膜水肿浸润,角膜缘新生血管长入角膜约2 mm。前房中深,下方积脓2 mm。本研究已通过本院伦理审批(审批号:HEC-KS-2023003KY)。患者既往史:近3 月前有左侧面部带状疱疹病史,2 月余前无明显诱因出现左眼红痛,伴视力下降,于外院诊断为“左眼角膜溃疡、睑内翻”,对患者进行左眼睑内翻矫正术,术后病情加重,且佩戴绷带镜治疗效果较差。患者为进一步治疗至本院就诊,门诊以“细菌性角膜溃疡(左)”收入院。
入院体格检查:体温36.2 ℃,脉搏(heart rate,HR)98次/min,血压94/67 mmHg,呼吸频率(respiratory rate,RR)24 次/min。眼科检查:左眼视力HM 30 cm,矫正无助,右眼视力1.0;眼压:左眼16 mmHg,右眼14 mmHg;双眼睑肥厚充血,睑板腺堵塞,左眼头面部皮肤色素瘢痕,结膜混合性充血,结膜囊有大量黄色分泌物,鼻侧纤维结缔组织长入角膜2 mm,角膜中央灰白色溃疡下方浸润明显,角膜表面与边缘尚光滑,隐见后弹力层皱褶。见图1。
图1 1 例牙龈二氧化碳噬纤维菌感染角膜溃疡患者的角膜荧光染色前(1A)和染色后(1B)眼前段图像
辅助检查:共聚焦显微镜观察左眼角膜可见病灶周围上皮组织结构不清,有大量炎症细胞及树突状细胞,局部有片状高反光,前弹力层未见神经纤维走行,基质层结构紊乱,细胞呈激活状,可见松针样高反光及多量点状高反光颗粒,内皮层窥不清(图2)。前节光学相干断层扫描(optical coherence tomography,OCT)显示左眼角膜病灶水肿,下方基质变薄,浸润约3/4 角膜厚度,内皮面不光滑;眼前段照相,扫描激光眼底检查与描述相符。生化检验:红细胞计数(red blood cell count,RBC)3.25×1012/L,红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)116 mm/h,血红蛋白(hemoglobin,Hb)106 g/L,血细胞比容(hematocrit,HCT)0.322,抗U1 小核糖核蛋白抗体+,抗SSA/62 抗体+。
注:可见松针样高反光及多量点状高反光颗粒
1.2 研究方法
1.2.1 涂片镜检及细菌分离培养 角膜局部滴麻药,沿溃疡面边缘进行刮取,将刮取物接种于哥伦比亚血平板、中国蓝培养基、沙保罗培养基,同时取标本涂片,革兰染色后镜检,接种后的标本置于5%CO2,35 ℃培养箱,观察菌落24~96 h 的生长情况。对培养48 h 后的菌落进行药敏试验。
1.2.2 细菌鉴定 使用全自动微生物鉴定系统和NH 鉴定卡进行菌种鉴定。并对纯培养细菌进行16S rRNA 基因序列分析以及质谱仪分析鉴定。
1.2.3 药敏试验 参考文献[8],在含5%绵羊血的MH 培养基上进行药敏试验,观察24 h、48 h、72 h、96 h 后细菌在血MH 培养基的生长和抑菌情况,以培养96 h 的结果作为最终结果。β-内酰胺酶试验以30 min 内观察纸片变红为阳性。
2.1 角膜刮取物涂片镜检及细菌分离培养结果患者左眼角膜刮片经革兰染色,可见较多细长革兰阴性杆菌。见图3。
图3 1 例牙龈二氧化碳噬纤维菌感染角膜溃疡患者的角膜刮片油镜下形态(革兰染色)
培养24 h 可见菌落几乎无生长,但仔细观察可见在哥伦比亚血平板接种面有扁平、微凸、粗糙菌落生长,由于角膜取物标本较少,菌落不明显,革兰染色镜检发现细长、梭形革兰阴性杆菌(图4A),与角膜刮片革兰染色结果一致。培养72 h 后,菌落微凸、扁平、粗糙,微显黄色(图4B)。中国蓝和沙保罗平板未见菌落生长。
该分离物的氧化酶和触酶试验均为阴性,初步鉴定使用全自动微生物分析系统和GN 卡,被鉴定为气单胞菌,但是该菌株与气单胞菌的化学反应和菌落形态,镜下形态都不相符;参考文献[8],使用梅里埃NH 鉴定卡,鉴定结果为二氧化碳噬纤维菌属,可信度为94%,之后进行16S rRNA 基因测序和质谱分析,质谱结果和基因测序结果(图5)均验证了该菌株为牙龈二氧化碳噬纤维菌。
图5 牙龈二氧化碳噬纤维菌培养24 h 菌落的16S rRNA 部分测序结果
2.2 药敏试验 参考文献并结合临床用药,在含5%绵羊血的MH 培养基上进行药敏试验,选用药物为氨苄西林、头孢呋辛、头孢他啶、头孢他啶/棒酸、头孢噻肟、头孢噻肟/棒酸、头孢哌酮/舒巴坦、亚胺培南、丁胺卡那、头孢曲松、加替沙星、环丙沙星。观察24 h、48 h、72 h、96 h 后细菌在培养基上的生长情况。24 h:无明显细菌生长,48 h:仍无法辨认细菌有明显生长,72 h:观察到在血MH 平板上有粗糙的白色菌落生长,96 h:判读药敏结果为氨苄西林≥32 mg/L、头孢呋辛≥256 mg/L、头孢他啶≥32 mg/L、头孢他啶/棒酸≤0.25 mg/L、头孢噻肟≥32 mg/L、头孢噻肟/棒酸≤0.25 mg/L、头孢哌酮/舒巴坦≤0.5 mg/L、丁胺卡那≥256 mg/L、头孢曲松≥32 mg/L、加替沙星≥32 mg/L、环丙沙星≥32 mg/L、亚胺培南≤0.0125 mg/L。与部分该菌属对β-内酰胺类和大环内酯类药物耐药一致[5-7],但该菌对氨基糖苷类和喹诺酮类也耐药,临床选用亚胺培南进行滴注,患者角膜炎症得到控制,但溃疡面未见明显愈合,因此进行羊膜移植术,促进角膜溃疡面愈合,抑制新生血管形成。术后,使用小牛血去蛋白提取眼用凝胶、托百士眼药水、百力特眼药水滴眼,炎症得到控制,术后3 d 患者出院。术后30 d 患者复诊,可见左眼结膜充血,羊膜组织溶解,缝线在位,角膜灰白色水肿混浊,下方瓷白色浸润,上皮组织周围长入,角膜缺损面积约为4 mm×6 mm,眼压正常,视力HM 10 cm。右眼下睑内卷,睫毛倒向眼球表面,扎刺角膜,后住院行左眼羊膜移植术和右眼睑内翻矫正术,营养角膜及抗感染治疗,术后1 周出院随访,溃疡得到控制,为患者保住眼球,提高生活质量。
总结本病例有以下特点:① 患者为老年女性,有左侧面部带状疱疹病史4 个月、甲状腺功能减退病史3年、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮病史2年;② 实验室检查:红细胞沉降率107 mm/h,抗U1 小核糖核蛋白抗体和抗SSA/62 抗体均为阳性;③ 双眼睑内翻,下睑缘内卷,睫毛倒向眼球表面,扎刺角膜;④ 患者为环卫工人,卫生条件较差,导致作为口腔正常菌群的牙龈二氧化碳噬纤维菌引起角膜感染;⑤ 该菌产β-内酰胺酶,对大环内酯类和喹诺酮类耐药,常规广谱抗菌药物并不能抑制细菌生长,导致角膜感染得不到有效缓解。综合本例患者的病史、临床表现、免疫学、眼科共聚焦显微检查、影像学、病原学检查结果,考虑由于患者免疫力低下,睑内翻导致角膜、结膜长期处于扎刺、磨损的条件下,个人卫生不理想导致牙龈二氧化碳噬纤维菌角膜炎,该菌对广谱抗菌药物耐药,患者未进行规范治疗,而引起角膜溃疡。
在菌株分离鉴定及药敏试验中,由于该菌生长缓慢,且角膜溃疡较深,角膜刮片能取到的标本较少,如果用拭子常规取材后再送到实验室进行涂片、接种,可能影响培养结果,因此正确的取材方法和床边接种才能保证眼科标本检验的阳性率。由于实验室条件和经验不足,试验耗时较长,但目前有质谱仪的眼科医院不多,虽然有文献报道质谱仪的细菌谱也影响鉴定结果,只有16S rRNA 基因测序才是鉴定到种的“金标准”[3],但多数文献中质谱鉴定和16S rRNA 基因测序的结果一致,可以确定到种。目前,对动物源性和人类口腔正常菌群狗咬二氧化碳噬纤维菌和生痰二氧化碳噬纤维菌的报道较多[7-9],多为通过血培养得到的分离株,也有对生痰二氧化碳噬纤维菌眼内炎的报道[9]。虽然目前没有药敏试验方法和判断标准,但很多报道表明二氧化碳噬纤维菌已出现不同程度的耐药[10-11],而未见牙龈二氧化碳噬纤维菌角膜病的报道,该分离株菌株β-内酰胺酶阳性,对大环内酯类、氨基糖苷类、喹诺酮类均耐药,只对碳氢酶烯类和复合抗菌药物敏感,因此,眼科专科医院可选择的抗菌药物较少。本病例选择亚胺培南滴注,使炎症得以控制,为进一步促进角膜修复,患者进行了羊膜移植术。一个月后复诊时,患者左眼角膜缺损面减小为4 mm×6 mm,羊膜溶解,为促进溃疡面愈合,再次进行羊膜移植术,同时进行了右眼睑内翻矫正术,改善了双眼的条件,术后1 周患者出院,预后良好。目前针对该菌感染导致的角膜溃疡报道少见,本病例对角膜溃疡标本的取材、培养分离、多种方法鉴定、药敏试验、治疗方案进行分析,在鉴定和进行药物敏感性试验时,可以为不论是否具备质谱仪的实验室提供帮助。
综上所述,虽然二氧化碳噬纤维菌的感染率不高,但近年的病例数也在增加,可能由于质谱鉴定的普及为菌株鉴定提供了更准确的结果。口腔正常菌群中的二氧化碳噬纤维菌感染好见于免疫力低下患者,多重耐药多见。因此,合理的标本采集方法、及时准确的鉴定和药敏结果能够指导临床医师更及时、合理地调整治疗方案,更早给予有效治疗,从而提高二氧化碳噬纤维菌感染的检出率和治愈率。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突