凝胶微柱直接抗人球蛋白试验在卵巢癌患者中的应用价值

陈玮媛 张萍萍 雷棽 王翠碧 熊磊群 戎瑞明 屠蕊沁 吴擘颋 吕小英

自身免疫性溶血性贫血（autoimmune hemolytic anemia，AIHA）患者可产生针对自身红细胞抗原的抗体，导致红细胞破坏，当红细胞破坏超出了机体的代偿能力，则会出现贫血症状。早期免疫血液学研究表明，副癌AIHA 可见于妇科肿瘤，尤其是卵巢畸胎瘤和卵巢囊肿患者，近期的研究进一步显示副癌AIHA 亦可出现在卵巢癌患者中，甚至有时可充当恶性肿瘤进程的标志物［1-2］。

直接抗人球蛋白试验（direct antiglobulin test，DAT）通过使用抗人球蛋白试剂形成肉眼可见的凝集反应，是证实红细胞膜上结合抗体或补体的标准方法［3］。随着自动化血型鉴定仪器的发展，凝胶微柱卡广泛应用于临床实验室。凝胶微柱直接抗人球蛋白试验（gel microcolumn direct antiglobulin test，GM-DAT）具有灵敏度高、操作便捷的特点。然而目前对GM-DAT 的临床价值，尤其是弱阳性GM-DAT结果的解读仍然存在争议。

本研究分析了妇科疾病患者的GM-DAT 检测结果，调查卵巢肿瘤包括卵巢畸胎瘤和卵巢癌患者的GM-DAT 阳性率，从副癌AIHA 发病机制的角度对GM-DAT 阳性在卵巢肿瘤患者中的临床意义进行了初步探索，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 连续性纳入2018 年9 月—2019 年2 月入院的354 例妇科患者作为研究对象。

1.1.1 纳入标准 ① 确诊为妇科疾病者；② 依从性较好者；③ 可正常沟通交流者。

1.1.2 排除标准 ① 存在活动性感染者；② 系统性自身免疫性疾病患者；③ 妊娠期女性；④ 拒绝配合本研究者。

1.1.3 伦理学 本研究符合医学伦理学标准，并通过本院伦理委员会审批（审批号：B2023-011），所有对检测均获得过受检者或家属的知情同意。

1.2 仪器与试剂 单一特异性抗-免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）和抗-C3d 试剂（均购自上海血液生物医药有限责任公司）；IH-1000 自动化血型鉴定仪（购自瑞士达亚美有限责任公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 临床诊断和实验室数据收集 通过电子病历系统获得患者的临床诊断和实验室检查结果，包括全血细胞计数、总胆红素（total bilirubin，TBil）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、直接胆红素（direct bilirubin，DBil）、人附睾蛋白4（human epididymis protein 4，HE4）以及糖类抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）等。

1.3.2 GM-DAT 采用IH-1000 自动化血型鉴定仪进行GM-DAT 检测，患者血标本采用乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetra-acetic acid，EDTA）抗凝。阳性标本使用标准试管法进行验证以及单一特异性抗-IgG 和抗-C3d 分型。

1.4 统计学分析 使用SPSS 20.0 和Shapiro-Wilk统计软件处理数据并检验评估数值变量。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t检验比较两组间差异；不符合正态分布的计量资料以中位数（四分位数）〔M（QL，QU）〕表示，以U检验比较两组间差异。计数资料则以例（百分比）表示，采用χ2检验或Fisher 精确检验比较两组间差异。双侧P＜0.05 视为具有统计学意义。

2 结果

2.1 患者的GM-DAT 结果 本研究纳入354 例妇科疾病患者，年龄20～86 岁，平均（50.1±13.4）岁；包括129 例恶性肿瘤患者，其中宫颈癌56 例，卵巢癌47 例，子宫内膜癌18 例，输卵管癌5 例，外阴癌3 例。354 例妇科疾病患者中检出GM-DAT 阳性7 例（总检出率为2.0%），其中卵巢癌患者的检出率为10.6%（5/47）；输卵管癌的检出率为20.0%（1/5），卵巢畸胎瘤的检出率为5.0%（1/20）。GM-DAT 在妇科恶性肿瘤患者中的阳性率明显高于妇科非恶性肿瘤患者（4.7%比0.4%，P＝0.019）。354 例妇科疾病患者的临床诊断和GM-DAT 阳性分布见图1。

图1 354 例妇科疾病患者的临床诊断和GM-DAT 阳性分布

除了1 例卵巢畸胎瘤患者的阳性GM-DAT 呈现2+的凝集强度且分型为1+抗-IgG 和1+抗-C3d以外，其余患者的阳性GM-DAT 仅表现为弱阳性（+/-），试管法抗-IgG 和抗-C3d 检测均为阴性。

2.2 卵巢癌患者的GM-DAT 结果 47 例卵巢癌患者中检出5 例弱阳性GM-DAT，相较于GM-DAT 阴性的卵巢癌患者，GM-DAT 阳性的卵巢癌患者年龄更大（岁：68.4±6.8 比55.9±11.5，P＝0.009），血红蛋白（hemoglobin，Hb）水平更低（g/L：94.8±16.3 比111.9±18.0，P＝0.048）。GM-DAT 阴性和阳性的卵巢癌患者的年龄、输血史、妊娠史和检验指标等资料比较见表1。

表1 GM-DAT 阳性与阴性卵巢癌患者的临床特征比较

3 讨论

本研究结果显示，妇科恶性肿瘤尤其是卵巢癌患者的GM-DAT 阳性率升高，表明副癌AIHA 形成过程中卵巢抗原暴露的可能。

妇科相关副癌AIHA 的最早记录可以追溯至20 世纪30 年代，1 例卵巢畸胎瘤患者行脾切除术治疗无效，但切除畸胎瘤后溶血症状缓解［4］。随后，副癌AIHA 主要集中报道于卵巢畸胎瘤患者中［5-8］。近期有文献表明，卵巢癌诊断前、中、后均可出现副癌AIHA［1-2，9］。本研究利用GM-DAT 这一高自动化、高灵敏度的检测方法得出卵巢癌患者中DAT 阳性检出率偏高。

GM-DAT 检测中，凝胶微柱内含有抗人球蛋白试剂，在离心过程中将与抗人球蛋白试剂反应、凝集的红细胞滞留于凝胶孔筛中，而不反应的红细胞则被滤过，留存于凝胶底部。与传统试管法比较，GM-DAT 的灵敏度可达98.4%～100%［10-11］。GMDAT 检测具有双重优势：① 凝胶微柱卡中的抗-IgG试剂为来源于兔的多克隆抗体，偶而可检出红细胞上致敏的IgA 或IgM 分子；② GM-DAT 可检出少量的致敏IgG 或C3d，检测限低于传统试管法。然而目前对试管法阴性而GM-DAT 阳性检测结果的临床意义仍存在争议，有时会被认定为由巨红细胞或白细胞增多引起的假阳性结果［12］。尽管健康人群的红细胞上可出现少量的IgG 或补体［13-14］，但本研究中GM-DAT 弱阳性的卵巢癌患者出现了轻度贫血，表明卵巢癌患者中GM-DAT 弱阳性可能已造成了某种程度的红细胞破坏。

卵巢肿瘤患者红细胞自身免疫现象的潜在机制仍然未知。卵巢皮样囊肿中可检出抗体，且囊液抗体滴度高于患者血清抗体滴度［15-16］，因此早期研究推断卵巢肿瘤直接生成了红细胞自身抗体。但某些患者囊液中未检出红细胞自身抗体，且生物素标记的红细胞自身抗体未结合至囊组织上［17］。目前关于卵巢肿瘤患者出现副癌AIHA 的假说主要包括两种：① 肿瘤抗原刺激机体产生的抗体对红细胞具有交叉反应性；② 肿瘤释放的物质促使红细胞膜上的抗原产生免疫原性［18］。卵巢肿瘤的患病风险随着年龄增长而增加［19］，年龄越大的患者卵巢肿瘤分期越高，预后越差［20-21］。由于GM-DAT 弱阳性的卵巢癌患者通常年龄较大，GM-DAT 阳性可能也是此类患者潜在的危险因素，对卵巢癌预后的影响有待进一步研究。

妇科恶性肿瘤患者的GM-DAT 阳性率较高表明其发生副癌AIHA 的风险也较高。本研究中卵巢癌患者的GM-DAT 阳性率为10.6%，是已有文献报道的卵巢癌相关AIHA 确诊率的7.6 倍［9］。而在相对少见的输卵管癌患者中，GM-DAT 的阳性率高达20.0%。这意味着红细胞自身免疫对妇科恶性肿瘤患者具有潜在的临床意义。临床对不同贫血类型患者的治疗措施有一定差异［22］，应用GM-DAT 可鉴别和区分妇科恶性肿瘤患者晚期常出现的慢性贫血与副癌AIHA，为治疗方案的制定提供参考依据。

副癌AIHA 的治疗原则与普通AIHA 不同。除了少数IgA 介导的副癌AIHA 仍对免疫抑制剂有效外［1］，大部分副癌AIHA 使用皮质类固醇和脾切除术均无法缓解［6，8，23］。副癌AIHA 的治疗原则是治疗原发病，切除卵巢肿瘤后患者贫血症状改善［6，8］。由于术前贫血和术中潜在出血风险，可优先选择腹腔镜手术方式［23］。因铂类化合物可能出现药物诱导的溶血性贫血，建议使用紫杉烷代替标准铂类化合物作为一线化疗药物［1］。

本研究有待进一步深入，不足之处主要有以下方面。首先，GM-DAT 阳性的标本可进行放散试验从而验证抗体的特异性；其次，随访信息可为GMDAT 阳性在卵巢癌中的临床意义提供更多的证据。妇科肿瘤相关AIHA 的潜在机制仍有待完善。

综上所述，妇科恶性肿瘤尤其是卵巢癌患者的GM-DAT 阳性率较高，弱阳性GM-DAT 的卵巢癌患者可出现轻度贫血，提示红细胞自身免疫现象和潜在的副癌AIHA。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突