血清miR-200a、miR-152水平与妊娠滋养细胞肿瘤化疗患者预后的关系

吴静 赵妍 张珂 杨景 孟胜君

湖南省妇幼保健院妇科 （长沙 410000）

妊娠滋养细胞肿瘤（gestational trophoblastic neplasma，GTN）是胚胎滋养细胞异常增殖形成的肿瘤，是一种较为罕见的恶性妇科肿瘤疾病［1-2］。GTN的诊断和疗效评估在大多数情况下是通过监测血清人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）和组织学证据来进行的，但影响其水平高低的因素众多［3］。特异性生物标志物越来越多的被用作鉴别诊断和预后评估，从而为GTN带来不同的治疗方案和预后［4］。既往研究缺乏时效性强且便捷的GTN预后评估方法，因此相关血清生物标志物的探讨十分重要。WU等［5］研究表明，微小RNA（microRNA，miRNA）-200a在妊娠期高血压疾病患者中表达上调，且可通过靶向下游基因促进滋养层细胞增殖、迁移和侵袭，抑制凋亡。既往研究显示，miR-152表达增加可促进滋养层细胞的凋亡［6］。上述研究中miR-200a、miR-152均与滋养层细胞的生物学行为有关，但二者在GTN中的表达情况及临床作用仍不十分明确。因此，本研究通过探究GTN患者化疗期间血清miR-200a、miR-152的表达水平变化，以期为改善预后提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料样本量计算：利用PASS15软件进行样本量计算，双侧检验，设OR= 2，α = 0.05，power = 90%，计算得到观察组和对照组各79例，考虑可能有失访人数，失访率按20%计算，则观察组和对照组至少需要95例。采用病例对照研究选取2019年6月至2022年12月期间本院就诊且行甲氨蝶呤（MTX）方案方案化疗的100例GTN患者为观察组，选取同期体检健康女性103例为对照组，对照组年龄、妊娠史与观察组匹配。研究对象本人已提供知情同意书，本研究获取医院伦理委员会批准，伦理批号：2020-S037。

观察组纳入标准：（1）临床特征、影像学检查、病理诊断确诊，符合其诊断标准［7］，既往均无妊娠期高血压；（2）患者化疗过程中依从性高，且无过敏反应；（3）年龄≥18周岁，临床资料完整；（4）精神状态正常，可正常沟通交流。排除标准：（1）伴其他类型恶性肿瘤者；（2）免疫功能紊乱、脏器功能异常者；（3）合并其他可引起血清HCG水平异常的疾病者。对照组纳入标准：年龄≥18周岁，临床资料完整，体检结果显示体格健康，无GTN或其他器质性疾病，精神状态正常，可正常沟通交流。排除标准：已参加其他研究。

1.2 方法

1.2.1 一般资料收集收集GTN化疗患者年龄（＜ 40岁，≥ 40岁）、收缩压、舒张压、距前次妊娠间隔时间（＜ 7个月，≥ 7个月）、前次妊娠性质（足月妊娠，流产，异位妊娠，葡萄胎）、病灶数（＜ 5个，≥ 5个）、病灶直径（＜ 5 cm，≥ 5 cm）、临床分期（Ⅰ+Ⅱ，Ⅲ+Ⅳ）、国际妇产科联盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）预后评分（＜ 7分，≥ 7分）、化疗前血HCG水平（＜ 10 000 U/L，≥ 10 000 U/L）。

1.2.2 血清miR-200a、miR-152表达水平检测采集对照组体检时及观察组治疗前、化疗第1个疗程、化疗第3个疗程空腹静脉血样5 mL，静置离心（3 500 r/min，10 min）并收集上层血清，-80 ℃保存待测。采用Trizol试剂（上海齐源生物科技有限公司，货号：QYK-12830）提取各血清样本中总RNA，测定纯度与浓度后，依照反转录试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，货号：mlE6067）操作说明将其反转录为cDNA。采用实时荧光定量PCR法检测血清miR-200a、miR-152表达水平，miR-200a上游引物5'-CGCATGCGCACTACTGACGAC-3'，下游引物5'-CTCTGTAGCGATCACGTCGTCG-3'；miR-152上游引物5'-CGCACGCTCTACGAGGA-CGA-3'，下游引物5'-TGAAGTAGTCGTACGCAGC-CT-3'；U6上游引物5'-GGACGTGGCGCTAGCGC-CA-3'，下游引物5'-CACGTCTGTACCACAGTCGA-C-3'。反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 1 min，40个循环。循环结束后采用2-ΔΔCT法计算血清miR-200a、miR-152的相对表达量。

1.2.3 疗效评估及预后分组MTX方案，MTX 0.4 mg/（kg·d）肌内注射，1次/d，连续5次；亚叶酸钙0.1 mg/（kg·d）于MTX注射24 h后肌肉注射，1次/d，连续5次，疗程间隔为2周，治疗3个疗程及以上。于化疗3个疗程后对患者进行评估，进展：病灶增大或转移，血清HCG水平与治疗前比较无显著变化或呈升高趋势；无变化：病灶缩小面积小于一半，血清HCG水平降低但仍处于异常情况；部分缓解：病灶面积缩小一半以上，血清HCG水平呈对数降低；完全缓解：各项临床症状消失，血清HCG水平恢复正常。根据化疗疗效将患者分为预后良好组（完全缓解+部分缓解）80例和预后不良组（进展+无变化）20例。

1.3 统计学方法采用IBM公司SPSS 23.0统计软件进行数据分析。计量资料经检验后服从正态分布，采用（±s）表示，两组比较采用独立样本t检验，不同化疗时间比较采用重复测量方差分析；计数资料采用例（%）表示，组间比较采用χ2检验；采用受试者工作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲线分析化疗前血清miR-200a、miR-152表达水平对GTN化疗患者预后不良的预测价值，曲线下面积（area under curve，AUC）比较行Z检验；GTN化疗患者化疗后预后不良与各指标的关系采用logistic回归分析。P＜ 0.05则表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对照组与观察组血清miR-200a、miR-152表达水平比较观察组血清miR-200a［（2.68 ± 0.62）vs.（1.02 ± 0.24）］表达水平高于对照组，miR-152［（0.68 ± 0.18）vs.（1.03 ± 0.22）］表达水平低于对照组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。

2.2 GTN化疗患者化疗前后血清miR-200a、miR-152表达水平比较随化疗时间延长，预后良好组与预后不良组血清miR-200a表达水平依次降低，miR-152表达水平依次升高（P＜ 0.05）。预后不良组治疗前、化疗第1个疗程、化疗第3个疗程的血清miR-200a表达水平高于预后良好组，miR-152表达水平低于预后良好组（P＜ 0.05）。重复测量方差分析结果显示，血清miR-200a、miR-152表达水平不同交互、时间及组间作用比较，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见表1。

表1 GTN化疗患者化疗前后血清miR-200a、miR-152表达水平比较Tab.1 Comparison of serum miR-200a and miR-152 expression levels before and after chemotherapy in GTN chemotherapy patients ±s

表1 GTN化疗患者化疗前后血清miR-200a、miR-152表达水平比较Tab.1 Comparison of serum miR-200a and miR-152 expression levels before and after chemotherapy in GTN chemotherapy patients ±s

注：与同组化疗前比较，aP＜0.05；与同组化疗第1个疗程比较，bP＜0.05

组别例数miR-200a/U6化疗前2.61 ± 0.59 2.94 ± 0.64 F交互 = 61.173、F时间 = 42.990、F组间 = 26.479 P交互 ＜ 0.001、P时间 ＜ 0.001、P组间 ＜ 0.001预后良好组预后不良组F值P值80 20化疗第1个疗程2.21 ± 0.38a 2.54 ± 0.55a化疗第3个疗程1.82 ± 0.33ab 2.20 ± 0.40ab化疗第1个疗程0.82 ± 0.20a 0.55 ± 0.18a化疗第3个疗程0.97 ± 0.21ab 0.68 ± 0.17ab--miR-152/U6化疗前0.74 ± 0.19 0.43 ± 0.16 F交互 = 16.880、F时间 = 24.531、F组间 = 106.537 P交互 ＜ 0.001、P时间 ＜ 0.001、P组间 ＜ 0.001

2.3 化疗前血清miR-200a、miR-152表达水平对GTN化疗患者预后不良的预测价值以化疗前血清miR-200a、miR-152表达水平单独及联合预测概率值为检验变量，以GTN化疗患者是否发生预后不良为状态变量绘制ROC曲线，结果显示，化疗前血清miR-200a、miR-152表达水平单独及联合预测GTN化疗患者预后不良的AUC分别为0.793、0.844、0.887，联合预测AUC显著高于单独预测AUC（Z= 3.021、2.027，P＜ 0.05）。见图1、表2。

图1 化疗前血清miR-200a、miR-152表达水平预测GTN化疗患者预后不良的ROC曲线Fig.1 Receiver operating characteristic of serum miR-200a and miR-152 expression levels predicting poor prognosis of GTN chemotherapy patients before chemotherapy

表2 化疗前血清miR-200a、miR-152表达水平单独及联合预测GTN化疗患者预后不良的价值Tab.2 Value of predicting poor prognosis of GTN chemotherapy patients with serum miR-200a and miR-152 expression levels before chemotherapy alone and in combination

2.4 GTN化疗患者化疗预后不良的单因素分析单因素分析结果显示，预后良好组与预后不良组年龄、收缩压、舒张压、距前次妊娠间隔时间、前次妊娠性质、病灶数、病灶直径、临床分期比较，差异无统计学意义（P＞ 0.05）。预后良好组与预后不良组FIGO预后评分、化疗前血HCG水平比较，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见表3。

表3 GTN化疗患者化疗预后不良的单因素分析Tab.3 Single factor analysis of poor chemotherapy prognosis in GTN chemotherapy patientsxˉ±s

2.5 GTN化疗患者化疗预后不良与各指标关系的logistic回归分析以GTN化疗患者化疗后是否预后不良（是=1，否=0）为因变量，将单因素分析结果中差异有统计学意义的miR-200a（连续变量）、miR-152（连续变量）、FIGO预后评分（≥ 7分 = 1，＜7分 = 0）、化疗前血HCG水平（≥ 10 000 U/L = 1，＜10 000 U/L = 0）作为自变量进行logistic回归分析，结果显示，miR-200a、miR-152、FIGO预后评分≥7分与GTN化疗患者预后不良有关（P＜ 0.05）。见表4。

3 讨论

妊娠滋养细胞疾病是胚胎滋养细胞进入子宫肌层后转移至其它组织引起组织破坏或发生恶性增殖的一类妇科恶性肿瘤，包括良性葡萄胎和恶性GTN［8］。GTN包括绒毛膜癌、侵蚀性葡萄胎及中间型滋养细胞肿瘤等［9］。FIGO预后评分根据肿瘤侵犯的解剖部位将GTN患者进行危险分层，但其评分系统中关于低位分组范围问题存在很大争议［10］。

既往研究表明，miRNA在多种疾病的发生和发展中发挥着至关重要的作用，包括心血管疾病、肿瘤、内分泌紊乱和妊娠相关疾病［11-14］。近期研究揭示了部分miRNA的异常表达对滋养层细胞的凋亡、增殖、侵袭及血管生成有重要影响［15，16］。miR-200a作为miR-200家族重要成员之一，可通过调控上皮间质转化过程在多种肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移过程中起关键作用［17-19］。刘莹等［20］研究显示，miR-200a-3p可靶向转甲状腺素蛋白影响妊娠期高血压疾病滋养细胞增殖、迁移、侵袭等生物学行为。本研究结果显示，GTN患者血清miR-200a水平高于健康女性。提示miR-200a高表达在GTN的发生发展过程中可能发挥促进作用，基于既往研究推测细胞内环境被打破后，miR-200a表达水平出现显著升高，miR-200a可通过影响细胞黏附、激活等作用参与GTN患者机体病理生理过程，尤其在细胞增殖和侵袭方面，与刘莹等［20］研究结论相似。然而许多研究表明，miR-200a在多数肿瘤中表达下调，可抑制细胞增殖、迁移等生物学过程，发挥抑癌基因作用［21-22］。本研究结果与其结论相反，推测miR-200a在不同肿瘤的发生发展中可能发挥不同作用，有待相关基础研究进一步验证。近年来发现miR-152是miRNA家族中与细胞增殖、分化、凋亡关系密切的成员之一［23-25］。本研究结果中，GTN患者血清miR-152低表达。基于既往研究中miR-152与细胞生物学行为的关系推测：miR-152参与GTN滋养细胞恶性增殖的作用机制可能同样与上皮间质转化有关，miR-152病理性低表达可能造成滋养细胞转化为具有间质表型的细胞，其细胞黏附功能及极性下降，恶性增殖、迁移及侵袭的能力增加。

此外，本研究结果中化疗前血清miR-200a、miR-152表达水平对GTN化疗患者预后不良有重要预测价值，经化疗治疗后二者在不同预后患者中的表达水平趋势不变。表明治疗前miR-200a高表达、miR-152低表达可能影响治疗GTN的疗效和预后，临床中可通过检测治疗前血清miR-200a、miR-152表达水平对患者预后进行及时预测，对于预测结果显示为预后不良高危患者，可考虑从单药方案转为依托泊苷、MTX、Act-D、环磷酰胺和长春新碱联合化疗，甚至考虑行全子宫双侧输卵管切除术。患者血清miR-200a高表达、miR-152低表达表明其肿瘤恶性风险较大，炎症反应大，滋养细胞恶性转化能力强，进而影响化疗疗效，不利于预后。

综上，血清miR-200a表达升高、miR-152表达降低可能不利于GTN化疗疗效提升，并提示GTN患者预后不良。本研究创新性：既往研究缺乏时效性强且便捷的GTN预后评估方法，而本研究以血清生物指标miR-200a、miR-152作为GTN化疗预后的预测指标，其检测快速便捷、时效性高、价格低廉，临床医生可通过早期密切观察miR-200a、miR-152水平变化，将其作为依据有效地进行预后评估并选择最佳的治疗方案，提高受影响妇女的总体生存率。不足之处：本研究样本较小，且预后不良与预后良好组病例数差异较大，统计学结果可能存在偏倚。今后进一步的研究中将验证miR-200a和miR-152作为预后标志物的效果，并建立独立的验证集来验证二者预后价值；此外今后将通过更大样本量的临床研究及相关动物细胞实验证实miR-200a表达升高、miR-152表达降低是否与滋养细胞增殖侵袭相关。