ECM1基因在膀胱癌中的表达及其与临床病理特征及预后关系

肖峰 姜锡男 舒露 石家齐 陈方敏 穆毅

1贵阳市第一人民医院泌尿外科（贵阳 550002）；2贵州医科大学附属医院泌尿外科（贵阳 550001）；3天津市第三中心医院泌尿外科（天津 300170）

膀胱癌（bladder cancer，BLCA）是全世界常见的泌尿系统恶性肿瘤之一，每年有近38.6万新发病例和15万死亡病例［1］。在中国和美国，膀胱癌的发病率是泌尿系统肿瘤第1位，死亡率居第5位［2］。膀胱癌的发病率随着患者年龄的增加而增加，男性约是女性的4倍［3］。膀胱癌分为非肌层浸润性和肌层浸润性膀胱癌两类。非肌层浸润性膀胱癌的典型治疗方法是经尿道膀胱肿瘤切除术加膀胱灌注化疗。肌层浸润性膀胱癌患者通常接受根治性膀胱切除术和盆腔淋巴结切除术。非肌层浸润性膀胱癌的5年生存率超过90%，复发率高达60%，约20%的患者处于进展期［4］。同时，大约一半的接收手术治疗的患者出现复发或转移。肌层浸润性膀胱癌患者5年死亡率约为50%，局部进展或复发的患者预后更差。因此，寻找新型标志物预测膀胱癌复发及预后对其管理和治疗至关重要。

细胞外基质蛋白1（extracellular matrix protein 1，ECM1）是一种在上皮中表达并分泌到细胞外基质的糖蛋白［5］。ECM1在乳腺癌、喉癌、肝癌、胆管癌、食管鳞癌、胃癌、结直肠癌、肺癌等多种恶性肿瘤中表达显著增加［6-8］。此外，ECM1参与癌细胞增殖、血管生成、迁移和转移等多种生物学过程。研究发现ECM1表达增加促进多种癌症的发生和转移，并且ECM1过表达已被纳入癌症患者不良预后和转移潜能的评分模型中［9］。先前研究［10］报道ECM1与膀胱癌细胞的生长、迁移和凋亡密切相关，但ECM1表达与膀胱癌患者临床病理特征和预后的关系尚未有研究报道。因此，本研究通过对收治的膀胱癌患者作为研究对象，探讨膀胱癌组织中ECM的表达与患者临床病理特征和预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2018年1月至2019年12月贵州医科大学附属医院行根治术治疗的60例膀胱癌患者的癌组织及癌旁组织样本。其中男22例，女38例；年龄33 ～ 73岁，平均（54.56 ± 8.62）岁。所有膀胱癌患者的病理类型由2名经验丰富的病理学医生独立诊断。本研究已经获得医院伦理委员会批准。纳入标准：（1）术后经病理学鉴定为膀胱尿路上皮癌；（2）患者无放化疗及膀胱癌靶向治疗史；（3）临床材料完整。排除标准：（1）存在免疫系统等疾病者；（2）有心肝脾肾功能障碍和验证反复发作者；（3）有严重心脏疾病及认知功能损伤者；（4）有感染性疾病患者。

1.2 ECM1 mRNA表达检测采用是是荧光定量PCR（qRT-PCR）检测ECM1表达。将收集的癌组织样本和癌旁组织样本中提取总RNA，将RNA逆转录成cDNA。对cDNA进行qRT-PCR进行定量分析，具体操作步骤设置：95 ℃ 30 s，95 ℃30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共设置40个循环。以GAPDH为内参。ECM1mRNA的相对表达量采用2-△△Ct方法计算。ECM1引物序列F：5'-CCTGGGCTGATCCACAACAT-3'；R：5'-TTGGCGTTCTCAGTGTCTCC-3'。GAPDH引物序列F：ACCCCGTGCTGCACCGAG-3'；R：5'-TCCCGGCCAGCCAGGTCCA-3'。

1.3 免疫组化法检测ECM1表达情况收集癌组织样本和癌旁组织样本，用10%中性多聚甲醛固定，冰冻切片。用二甲苯Ⅰ和Ⅱ脱蜡，浸泡15 min。在无水乙醇中水化2次。蒸馏水冲洗后，用PBS浸泡，柠檬酸钠修复，10%山羊血清封闭，标一抗ECM1，洗涤后，标二抗，添加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素液。DAB显色后，用自来水冲洗，封片，显微镜下观察，拍照。根据染色强度对蛋白表达阳性、阴性评分。

1.4 随访术后通过电话访问、门诊复查等方式对所有患者进行随访，随访截止时间为2022年12月。

1.5 统计学方法采用SPSS 25.0软件进行统计学差异分析。计数资料用例（%）表示，采用χ2检验；计量资料以均数±标准差表示，组件比较采用独立样本t检验；Kaplan-Meier曲线分析ECM1表达与患者预后的关系；Cox风险比列回归模型评估膀胱癌患者预后的影响因素。P＜ 0.05为代表数据差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ECM1在膀胱癌组织及癌旁组织中表达的比较通过qRT-PCR检测了60例膀胱癌患者癌组织及癌旁组织中ECM1的mRNA表达，结果发现与癌旁组织相比，根据ECM1表达的均值（2.03 ±0.21，P＜ 0.01），分为ECM1高表达组和ECM1低表达组，膀胱癌组织中ECM1的mRNA表达水平显著增加。IHC染色结果发现癌组织中ECM1蛋白阳性率56.67%，癌旁组织中阳性率为13.33%，差异具有统计学意义，结果见表1、图1。

图1 膀胱癌和癌旁组织中ECM1的免疫组化检测结果Fig.1 Immunohistochemical results of ECM1 in bladder cancer and paracancer tissue

表1 ECM1在膀胱癌组织和癌旁组织中表达Tab.1 Expression of ECM1 in bladder cancer and adjacent tissues ±s

表1 ECM1在膀胱癌组织和癌旁组织中表达Tab.1 Expression of ECM1 in bladder cancer and adjacent tissues ±s

组别ECM1 mRNA ECM1 蛋白阳性［例（%）］癌组织4.96 ± 0.55 34（56.67）癌旁组织1.05 ± 0.04 8（13.33）t/χ2值78.32 24.76 P值＜ 0.05＜ 0.05

2.2 ECM表达在膀胱癌患者临床病理特征中的比较ECM1在膀胱癌病理Ⅲ级、TNMⅢ-Ⅳ期、淋巴结转移患者中表达显著高于病理Ⅰ-Ⅱ级、TNMⅠ-Ⅱ期及无淋巴结转移患者（P＜ 0.05）；ECM1表达在性别、年龄、吸烟史、肌层浸润、肿瘤大小、肿瘤数量等方面比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 ECM1表达在膀胱癌患者不同临床病理参数中比较Tab.2 The expression of ECM1 was compared in different clinicopathological parameters of bladder cancer ±s

表2 ECM1表达在膀胱癌患者不同临床病理参数中比较Tab.2 The expression of ECM1 was compared in different clinicopathological parameters of bladder cancer ±s

项目性别男女年龄例数ECM1表达t值P值22 38 4.71 ± 0.43 4.75 ± 0.44 0.3421 0.7335＜ 50岁≥ 50岁吸烟史是否肌层浸润是否病理分级Ⅰ-Ⅱ级Ⅲ级TNM分期Ⅰ-Ⅱ级Ⅲ级淋巴结转移是否肿瘤大小≤ 3 cm＞ 3 cm 28 32 4.80 ± 0.40 4.78 ± 0.42 0.1881 0.8514 34 26 4.81 ± 0.46 4.86 ± 0.44 0.4507 0.6537 36 24 4.91 ± 0.50 4.89 ± 0.53 0.1482 0.8827 20 40 2.93 ± 0.51 4.95 ± 0.53 14.09 0.0010 26 34 2.74 ± 0.33 4.91 ± 0.50 19.15 0.0010 24 36 5.01 ± 0.47 2.51 ± 0.20 28.38 0.0010 30 30 4.67 ± 0.38 4.69 ± 0.39 0.2012 0.8413

2.3 ECM1表达与膀胱癌患者预后的关系所有患者随访3年，60例膀胱癌患者死亡22例，生存38例，总生存率为63.33%。ECM1高表达这3年生存率为47.06%（16/34），低于低表达者的84.62%（22/26）；ECM1高表达和低表达患者总生存率比较，经Log-rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=3.262，P＜ 0.01），ECM1高表达的膀胱癌患者预后更差，生存曲线见图2。

图2 ECM1高表达及低表达的生存曲线Fig.2 Survival curve of ECM1 with high and low expression

接下来，我们分析了TCGA-BLAC数据集中ECM1表达与患者的预后关系，结果发现ECM1高表达组的膀胱癌患者预后较ECM1低表达组的预后生存时间短，差异有统计学意义，结果见图3。

图3 基于GEPIA 在线数据库分析 ECM1高表达及低表达的生存曲线Fig.3 Survival curve of ECM1 with high and low expression based on GEPIA

2.4 Cox回归分析影响膀胱癌患者预后的因素以膀胱癌患者预后为因变量，以ECM1高表达、病理分级Ⅲ、TNM分期、淋巴结转移为自变量，进行多因素Cox回归分析，结果显示，ECM1高表达是影响膀胱癌患者预后的独立危险因素（P＜ 0.001），见表3。

表3 影响膀胱癌患者预后的多因素Cox回归分析Tab.3 Multivariate Cox regression analysis of prognostic factors in patients with bladder cancer

3 讨论

膀胱癌是全球第十大常见恶性肿瘤之一，每年导致约15万例死亡。膀胱癌给各国社会经济带来负担，发病率和死亡率非常高。尽管在过去的几十年里进行了大量的研究，取得了很大的进步，但5年生存率仍然不理想。因此，寻找与膀胱癌密切相关的生物标志物对其早期诊断及个体化治疗具有重要意义。

ECM1最初于1994年被鉴定为一种大小为85 kDa的糖蛋白。目前，研究［11］表明ECM1参与多种生物学过程，如细胞增殖、血管生成、细胞凋亡、细胞迁移等过程。在大多数癌症中，ECM1被发现促进癌症的进展和侵袭，ECM1过表达被认为是不良预后的标志物，然而，关于ECM1在膀胱癌中的研究很少。本研究中，分析了60例旁观癌患者癌组织和癌旁组织中ECM1的表达，发现ECM1在膀胱癌癌组织中表达显著增加。这一结果与之前报道［12］的结果一致。同时，本研究发现ECM1在膀胱癌患者病理Ⅲ级、淋巴结转移和TNM分期后期表达显著增加，这结果说明ECM1表达与临床病理相关。ECM1发挥癌基因的功能，与在肺癌和肝癌的研究结果［13］相似。因此，笔者认为ECM1是膀胱癌发生和发展的关键调节因子。

先前的研究［14］显示ECM1高表达与乳腺癌及肝细胞癌患者的不良预后相关；这提示ECM1高表达在膀胱癌患者是否影响患者的预后。本研究分析结果显示：60例膀胱癌患者死亡22例，生存38例，总生存率为63.33%。ECM1高表达这3年生存率为47.06%（16/34），低于低表达者的84.62%（22/26）；ECM1高表达和低表达患者总生存率比较，经Log-rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=3.262，P＜ 0.01），ECM1高表达的膀胱癌患者预后更差。进一步进行Cox多因素回归分析，结果发现ECM1可以作为膀胱癌患者不良预后的独立危险因素。

本研究存在一些局限性，仅仅分析了膀胱癌组织中的表达差异，没有收集患者及健康人血液样本进行分析。在未来的研究中将进行大样本的分析及血液样本中的研究。

综上所述，膀胱癌组织中ECM1表达水平升高，与膀胱癌患者病理分级、TNM分期、淋巴结转移及预后有关，同时ECM1为膀胱癌预后的独立危险因素。