2种十字花科检疫性病菌快速检测方法的建立

于 璇,魏 霜,姜子德,王卫芳

(1.广州海关技术中心,广州 510623;2.华南农业大学植物保护学院,广州 510640)

【研究意义】十字花科细菌性黑斑病菌(Pseudomonassyringaepv.maculicola)和油菜茎基溃疡病菌(Leptosphaeriamaculans)能够侵染油菜籽,随农产品贸易经油菜籽传入我国的风险高,给我国农业生产带来重大安全隐患[1-4],上海、厦门等多个口岸曾从进口油菜籽中多次检出上述病菌[5-7]。传统检测方法周期长、灵敏度低,无法满足口岸通关需求。【前人研究进展】目前,油菜茎基溃疡病病菌和十字花科细菌性黑斑病菌常用的鉴定和检测方法包括分离培养法、常规PCR[8-9]、实时荧光定量PCR[10-11]、LAMP-LFD检测方法[12]、重组聚合酶等温扩增技术[13]、血清学检测方法[14]等。随着分子生物学的快速发展,PCR技术逐渐应用于植物致病菌的检测[2,9],但是检测中遇到的假阴性问题仍未得到有效解决,因此,多数学者认为在PCR检测方法中加入扩增内标(Internal amplification control,IAC)非常必要[15-16]。【本研究切入点】IAC-PCR方法已广泛应用于食品微生物和植物病毒检测[16-24],但尚未有应用于油菜籽中油菜茎基溃疡病病菌和十字花科细菌性黑斑病菌检测的研究报道。【拟解决的关键问题】通过人工构建一段随机序列并作为IAC添加进实时荧光PCR体系中,对体系进行优化,建立含有扩增内标的十字花科细菌性黑斑病菌和油菜茎基溃疡病菌的多重实时荧光PCR方法,并且从特异性、灵敏度以及实际样品检测等多个方面对该方法进行系统评价,以期建立能同时检测十字花科黑斑病菌与油菜茎基溃疡病菌的含扩增内标的多重实时荧光PCR方法,指示PCR反应中假阴性的情况,提高实验室检测效率及口岸对病菌的拦截率,为防止上述2种病菌随进口种子的传入提供技术保障。

1 材料与方法

1.1 实验材料

试剂:LB培养液(广州环凯微生物科技有限公司)、NA培养基(广州环凯微生物科技有限公司)、PDA培养基(广州环凯微生物科技有限公司)、Premix Ex Taqtm试剂(日本TaKaRa公司)、DL 2000 DNA Marker(日本TaKaRa公司)、6×Loading Buffer(日本TaKaRa公司)、TAE缓冲液(日本TaKaRa公司)、生理盐水、灭菌水、无水乙醇。

仪器:光照培养箱(IPP110plus)、研磨仪(GT200)、台式冷冻离心机(2-16KL)、核酸光标记仪(HG-EMA)、荧光定量PCR仪(QuantStudios5)、PCR仪(T100TMThermal Cycler)、凝胶成像系统(Geldoc XR+)、核酸蛋白分析仪(ND2000)。

菌株:十字花科细菌性黑斑病菌菌株(P.syringaepv.maculicola)、油菜茎基溃疡病菌(L.maculans)菌株为广州海关技术中心植物检疫研究所在进口油菜籽中分离、鉴定、保存的菌株,其他菌株为广州海关技术中心植物检疫研究所保存菌株,编号为:油菜茎基溃疡病菌(L.maculans)(1371,1358,1362)、油菜黑胫病菌(L.biglobosa)(Z-5,Z-11)、番茄茎点霉(P.lycopersici)(P-1187)、葡萄茎枯病菌(P.glomerata)(P-3428)、炭疽菌属(Colletotrichumsp.)(2309)、链格孢属(Alternariasp.)(4523,4546)、十字花科细菌性黑斑病菌(P.syringaepv.maculicola)(1037,3846)、丁香假单胞菌番茄致病变种(P.syringaepv.tomato)(1059,1067,1125)、丁香假单胞菌豌豆致病变种(P.syringaepv.pisi)(4832,4845)、丁香假单胞菌黍致病变种(P.syringaepv.panici)(P-36)、丁香假单胞菌斑生致病变种(P.syringaepv.maculicola)(M-23)、丁香假单胞菌大豆致病变种(P.syringaepv.glycinea)(1146)、黄单胞属(Xanthomonassp.)(X-51,X-37)、假单胞属(Pseudomonassp.)(5861)、荧光假单胞(P.fluorescens)(2312,2315)。用新型植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN,目录号DP302,北京)分别提取病原真菌与病原细菌基因组DNA;用DNA提取试剂盒(达安基因,DA0591)提取实际样品的总DNA,测定DNA浓度。

引物与探针:十字花科细菌性黑斑病实时荧光PCR引物与探针序列参照国家标准《十字花科细菌性黑斑病检疫鉴定方法》(GB/T36844—2018),油菜茎基溃疡病菌实时荧光PCR引物与探针序列参照行业标准《油菜茎基溃疡菌病检疫鉴定方法》(SN/T 3685—2013);IAC探针应用Primer Premier 5.0软件设计,在NCBI网站中进行BLAST分析比较和评估,保证特异性。引物和探针序列如表1所示,均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物与探针序列

1.2 方法

1.2.1 IAC的构建 利用在线软件(http://www.bio-soft.net/sms/index.html)随机生成一段DNA序列,将其在NCBI中进行比照,若没有出现与之同源的DNA片段,在这段随机DNA序列上、下游分别连接十字花科细菌性黑斑病菌目标片段的引物序列,构成十字花科细菌性黑斑病菌目标DNA的扩增内标DNA序列。将扩增内标DNA序列委托人工基因合成,合成片段载体pUC57,计算拷贝数,-20 ℃保存备用,菌液置于甘油管中-70 ℃保存。

1.2.2 含IAC的多重实时荧光PCR体系优化 十字花科细菌性黑斑病菌与油菜茎基溃疡病菌引物筛选。十字花科细菌性黑斑病菌特异性引物PM1/PM3分别与油菜茎基溃疡病菌的4对特异性引物(Forward Primer/Reverse Primer,LM3/LM4,LMf/LMr,Lmb3/R2)进行普通多重PCR反应,反应体系为:DNA 2.0 μL(各1 μL),2×Permix ExTaq(Probe qPCR) 12.5 μL,10 μmol/L PM1/PM3各1.0 μL,10 μmol/L油菜茎基溃疡病菌特异性引物各1.0μL,ddH2O补足至25.0 μL。用1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。PCR反应程序为95 ℃ 1 min;95 ℃ 5 s,60 ℃ 1 min,40个循环。

十字花科细菌性黑斑病菌与油菜茎基溃疡病菌引物探针比例优化。通过对2种菌的引物比例、探针比例进行优化,最终建立多重实时荧光PCR反应体系,优化参数如表2所示。反应体系为:DNA 2.0 μL(各1.0 μL),2×Permix ExTaq(Probe qPCR) 10.0 μL,10 μmol/L引物按表2比例添加,10 μmol/L探针按表2比例添加,ddH2O补足至20.0 μL。PCR反应程序同“十字花科细菌性黑斑病菌与油菜茎基溃疡病菌引物筛选”。

表2 反应体系优化参数

1.2.3 优化IAC的添加量 检测灵敏度。通过拷贝数计算公式:(6.02×1023)×(ng/μL×10-9)/(DNAlength×660)=copies/μL计算出IAC拷贝数为1.114×1012/μL,10倍梯度稀释至1.114×100/μL。选取拷贝数为1.114×105、1.114×104、1.114×103、1.114×102、1.114×101、1.114×100/μL的IAC作为模板,进行实时荧光PCR扩增,反应体系为:DNA 1.0 μL,2×Permix ExTaq(probe qPCR) 10.0 μL,10 μmol/L PM1/PM3各1.0 μL,10 μmol/L IAC探针1.0 μL,ddH2O补足至20.0 μL。PCR反应程序同“十字花科细菌性黑斑病菌与油菜茎基溃疡病菌引物筛选”。

IAC添加拷贝数与探针浓度优化。以十字花科细菌性黑斑病菌与油菜茎基溃疡病菌DNA为模板加IAC进行多重实时荧光PCR反应,分别添加拷贝数为1.114×104、1.114×103、1.114×102、1.114×101/μL的IAC 1.0 μL,IAC探针添加量分别为0.3、0.5和0.7 μL,反应体系为:DNA 3.0 μL(各1.0 μL,IAC拷贝数按文中添加),2×Permix ExTaq(Probe qPCR) 10.0 μL,10 μmol/L PM1/PM3各1.0 μL,10 μmol/L探针0.25 μL,10 μmol/L Forward Primer/Reverse Primer各1.0 μL,10 μmol/L 探针0.5 μL,添加0.30、0.50、0.70 μL 10 μmol/L IAC探针,添加 ddH2O补足至20.0 μL,并设十字花科细菌性黑斑病菌与油菜茎基溃疡病菌的多重实时荧光PCR扩增作为对照。PCR反应程序同“十字花科细菌性黑斑病菌与油菜茎基溃疡病菌引物筛选”。

IAC特异性验证。以十字花科细菌性黑斑病菌DNA、油菜茎基溃疡病菌DNA、IAC分别为模板进行实时荧光PCR反应,反应体系为:DNA 2.0 μL,2×Permix ExTaq(Probe qPCR) 10.0 μL,10 μmol/L PM1/PM3各1.0 μL,10 μmol/L IAC探针0.50 μL,ddH2O补足至20.0 μL,并设以无菌水为模板的实时荧光PCR扩增作为阴性对照,PCR反应程序同“十字花科细菌性黑斑病菌与油菜茎基溃疡病菌引物筛选”。

1.2.4 含IAC的多重实时荧光PCR体系特异性验证 选取十字花科细菌性黑斑病菌2株、油菜茎基溃疡病菌靶标菌3株、非靶标菌19株,分别提取DNA作为模板,进行含IAC的多重实时荧光PCR扩增,反应体系为:DNA 2.0 μL,2×Permix ExTaq(Probe qPCR) 10.0 μL,10 μmol/L PM1/PM3各1.0 μL,10 μmol/L探针0.25 μL,10 μmol/L Forward Primer/Reverse Primer各1.0 μL,10 μmol/L 探针0.50 μL,10 μmol/L IAC探针0.50 μL,ddH2O补足至20.0 μL。PCR反应程序同“十字花科细菌性黑斑病菌与油菜茎基溃疡病菌引物筛选”。

1.2.5 含IAC的多重实时荧光PCR体系灵敏度测试 分别将浓度为6.9×101与1.6×101ng/μL的十字花科细菌性黑斑病菌和油菜茎基溃疡病菌的DNA 10倍梯度稀释至6.9×10-6和1.6×10-6ng/μL,作为模板分别进行含IAC的多重实时荧光PCR扩增,分别以无菌水为模板的含IAC多重实时荧光PCR和以无菌水为模板不含IAC的多重实时荧光PCR为阴性对照。反应体系为:DNA 2.0 μL,2×Permix ExTaq(Probe qPCR) 10.0 μL,10 μmol/L PM1/PM3或10 μmol/L Forward Primer/Reverse Primer各1.0 μL,10 μmol/L探针0.25 μL,10 μmol/L 探针0.5 μL,10 μmol/L IAC探针0.5 μL,ddH2O补足至20.0 μL,PCR反应程序同“十字花科细菌性黑斑病菌与油菜茎基溃疡病菌引物筛选”。

1.2.6 含IAC的多重实时荧光PCR体系检测实际样品 从进口的52批油菜籽与十字花科蔬菜种子样品中随机取样,提取DNA,分别进行含IAC的多重实时荧光PCR扩增,反应体系为:DNA 2.0 μL,2×Permix ExTaq(Probe qPCR) 10.0 μL,10 μmol/L PM1/PM3各1.0 μL,10 μmol/L探针0.25 μL,10 μmol/L Forward Primer/Reverse Primer各1.0 μL,10 μmol/L 探针0.50 μL,10 μmol/L IAC探针0.50 μL,ddH2O补足至20.0 μL。另设人工感染十字花科细菌性黑斑病菌和油菜茎基溃疡病菌的样品对照。PCR反应程序同“十字花科细菌性黑斑病菌与油菜茎基溃疡病菌引物筛选”。

2 结果与分析

2.1 IAC的构建

利用在线软件(http://www.bio-soft.net/sms/index.html)随机生成一段DNA序列,将其在NCBI中进行比照,没有出现与之同源的DNA片段,在这段随机DNA序列上、下游分别连接十字花科细菌性黑斑病菌目标片段的引物序列,构成十字花科细菌性黑斑病菌目标DNA的扩增内标DNA序列。

扩增内标序列:GCGAAACGACAGCAACAGTGACGTGTCGTCCCACAGGGGTCTATTGGGGAT CATGACCAAAGCCTCCGGGCGTAGTCATCTCTGTGG AGGGACCTTGCCATCGTGTTGCCGCTATCGACTCG。单划线部分是十字花科细菌性黑斑病菌上、下游引物,双划线部分是IAC探针。

2.2 含IAC多重实时荧光PCR体系优化

2.2.1 十字花科细菌性黑斑病菌与油菜茎基溃疡病菌引物筛选 以十字花科细菌性黑斑病菌与油菜茎基溃疡病菌DNA为模板,十字花科细菌性黑斑病菌特异性引物PM1/PM3分别与油菜茎基溃疡病菌的4对特异性引物(Lmb3/R2、LM3/LM4、 LMf/LMr、Forward Primer/Reverse Primer)进行普通多重PCR反应。从图1可知,与普通PCR对比,仅Forward Primer/Reverse Primer与PM1/PM3同时扩增出阳性条带,LMb3/R2、LM3/LM4产物328、276 bp与PM1/PM3产物307 bp条带大小相近,不好辨别,因此选取Forward Primer/Reverse Primer作为多重PCR体系中油菜茎基溃疡病菌的引物。

M:DL 2000 DNA Marke;1: PMI/PM3与Lm3/Lm4普通多重PCR结果;2: PMI/PM3与LMf/LMr普通多重PCR结果;3: PMI/PM3与Forward Primer/Reverse Prime 普通多重PCR结果; 4: PMI/PM3与Lmb3/R2普通多重PCR结果;5:Lm3/Lm4普通PCR结果;6: LMf/LMr普通PCR结果;7: Forward Primer/Reverse Prime普通PCR结果;8:Lmb3/R2普通PCR结果;9: PMI/PM3普通PCR结果;10: 阴性对照。M:DL 2000 DNA Marke;1: Multiplex PCR results of PMI/PM3 and LM3/LM4;2:Multiplex PCR results of PMI/PM3 and LMf/LMr;3: Multiplex PCR results of PMI/PM3 and Forward Primer/Reverse Primer;4: Results of multiplex PCR PMI/PM3 and Lmb3/R2;5:Result of PCR PMI/PM3 and LM3/LM4;6:Result of PCR LMf/LMr; 7: Result of PCR Forward Primer/Reverse Prime;8: Result of PCR Lmb3/R2;9: Result of PCR PMI/PM3;10: Negative control.图1 2种病菌引物筛选PCR反应Fig.1 Two kinds of pathogenic bacteria primers screened for the PCR reactions

2.2.2 十字花科细菌性黑斑病菌与油菜茎基溃疡病菌引物探针比例优化 当十字花科细菌性黑斑病菌与油菜茎基溃疡病菌的引物比例为0.8/1.0,探针比例为0.25/0.50时Ct值最小,扩增效率最好,理论上应该选择0.8/1.0作为本实验引物比例,但是由于IAC与十字花科细菌性黑斑病菌共用1对引物,会消耗掉一定量的引物,当探针比例为1/1时,十字花科细菌性黑斑病菌条带更亮,因此本研究确定多重实时荧光PCR反应体系中十字花科细菌性黑斑病菌与油菜茎基溃疡病菌引物比例为1/1,探针比例采用0.25/0.50。

2.3 IAC添加量优化

2.3.1 IAC检测灵敏度 分别以1.114×105、1.114×104、1.114×103、1.114×102、1.114×101、1.114×100/μL拷贝数的IAC为模板进行实时荧光PCR扩增。从图2可知,IAC的检测灵敏度为1.114×102/μL。为了使IAC对检测灵敏的影响降到最低,在确保内标能够清晰的指示假阴性的同时,尽量选择较低浓度,因此选择1.114×104、1.114×103、1.114×102、1.114×101/μL进行下一步实验,确定扩增内标的添加量。

图2 IAC检测灵敏度Fig.2 IAC detection sensitivity

2.3.2 IAC拷贝数与探针添加量优化 以十字花科细菌性黑斑病菌与油菜茎基溃疡病菌DNA为模板进行含IAC的多重实时荧光PCR扩增,根据2.3.1检测灵敏度结果,在确保内标能够清晰指示假阴性的同时,尽量选择较低浓度的原则,使其对检测灵敏的影响降到最低。因此排除拷贝数1.114×105/μL,分别添加拷贝数为1.114×104、1.114×103、1.114×102、1.114×101/μL的IAC,添加量分别为0.3、0.5和0.7 μL,从表3中可知,当添加拷贝数为1.114×104/μL时Ct值增大,影响灵敏度,当拷贝数添加1.114×103、1.114×102/μL时对PSM与LM的Ct值影响最小,考虑到当添加IAC的拷贝数为1.114×102/μL时,Ct值接近35,不容易判断,因此选择1.114×103/μL为本体系的拷贝数添加量;对比探针添加量可以看出,当探针添加0.5 μL时,PSM与LM的Ct值最小。所以在20.0 μL体系中,选择添加IAC拷贝数为1.114×103/μL,IAC探针添加量为0.5 μL。

表3 IAC拷贝数与探针添加量

2.3.3 IAC特异性验证 以十字花科细菌性黑斑病菌DNA、油菜茎基溃疡病菌DNA、IAC为模板分别进行实时荧光PCR扩增。从图3可知,仅IAC扩增出阳性曲线,目标菌为阴性,说明该IAC特异性良好。

1～3:IAC为模板的实时荧光PCR验证结果;4～6:十字花科细菌性黑斑病菌DNA为模板的实时荧光PCR验证结果;7～9:油菜茎基溃疡病菌DNA为模板的实时荧光PCR验证结果;NC:以无菌水为模板的阴性对照。1-3: Results of real-time PCR validation using IAC as template; 4-6: Results of real-time PCR validation using DNA as template of P. syringae pv. Maculicola;7-9: Results of real-time PCR validation using DNA as template of L. maculans; NC: Negative control.图3 IAC实时荧光PCR特异性验证结果Fig.3 Results of specificity verification by IAC real-time PCR

2.4 含IAC多重实时荧光PCR体系特异性验证

选取十字花科细菌性黑斑病菌2株与油菜茎基溃疡病菌3株靶标菌、19株非靶标菌提取DNA,作为模板进行含IAC的多重实时荧光PCR扩增与实时荧光PCR扩增。从图4可知,该反应特异性高,对非目标菌检测结果均为阴性,对目标菌检测结果均为阳性。

1～3:油菜茎基溃疡病菌含IAC多重实时荧光PCR扩增结果;4～5:十字花科细菌性黑斑病菌含IAC多重实时荧光PCR扩增结果;6～24:非靶标菌含IAC多重实时荧光PCR扩增结果;IAC:靶标菌与非靶标菌IAC实时荧光PCR扩增结果。1-3:Results of IAC-containing multiplex real-time PCR amplification of L. maculans;4-5:Results of IAC-containing multiplex real-time PCR amplification of P. syringae pv. Maculicola;6-24:Results of multiple real-time PCR amplification of non-target bacteria containing IAC;IAC:Real-time PCR amplification results of all IAC in the system.图4 含IAC的多重实时荧光PCR反应结果Fig.4 Multiple real-time qPCR reaction results of IAC-containing test strains

2.5 含IAC多重实时荧光PCR体系灵敏度测试

提取的十字花科细菌性黑斑病菌与油菜茎基溃疡病菌DNA浓度分别为6.9×101和1.6×101ng/μL,进行10倍稀释,稀释至6.9×10-6和1.6×10-6ng/μL,共8个浓度,作为模板进行含IAC的多重实时荧光PCR扩增。从图5可知,含IAC的实时荧光PCR对油菜茎基溃疡病菌的检测低限为1.6×10-4ng/μL;重复试验发现,当DNA浓度为6.9×10-5ng/μL时虽有扩增,但Ct值并不稳定,因此本方法对十字花科细菌性黑斑病菌的检测低限为6.9×10-4ng/μL。2种病菌同样DNA浓度梯度,分别按照标准中荧光PCR与含IAC的多重实时荧光PCR扩增,检测低限相同,证实在PCR体系中添加适宜浓度的IAC片段不会降低检测灵敏度。

a和c分别为油菜茎基溃疡病菌含IAC多重实时荧光PCR和单重实时荧光PCR的灵敏度测试结果;1～6:1.6×101～1.6×10-4 ng/μL的DNA浓度。b和d分别为十字花科细菌性黑斑病菌含IAC多重实时荧光PCR和单重实时荧光PCR的灵敏度测试结果;1～7:6.4×101 ～6.4×10-5 ng/μL的DNA浓度。IAC:含IAC的多重实时荧光PCR扩增结果;NC:阴性对照。a and c show the sensitivity test results of multiple real-time PCR and single real-time PCR containing IAC for L. maculans, respectively; 1-6:DNA concentration of 1.6×101-1.6×10-4 ng/μL.b and d show the sensitivity test results of multiple real-time PCR and single real-time PCR containing IAC for P. syringae pv.Maculicola, respectively.1-7:DNA concentration of 6.4×101-6.4×10-5 ng/μL;IAC:Real-time PCR amplification results of all IAC in the system;NC:Negative control.图5 含IAC多重实时荧光PCR方法与单重实时荧光PCR方法检测灵敏度比较Fig.5 Comparison of the sensitivity of multiple real-time PCR with IAC and single real-time PCR

2.6 含IAC多重实时荧光PCR检测实际样品

对进境的52批油菜籽和十字花科蔬菜种子分别提取DNA后,进行含IAC的多重实时荧光PCR扩增(表4),通过与人工添加十字花科细菌性黑斑病菌和油菜茎基溃疡病菌的样品和以无菌水为模板的12批阴性对照比较,62份样品结果一致,编号10、39的2个样品IAC没有被扩增,表明PCR反应假阴性,需要重新检测。2个样品经过重新提取DNA,再次进行含IAC的多重实时荧光PCR检测,其中编号10的样品为十字花科细菌性黑斑病菌阳性,编号39的样品为十字花科细菌性黑斑病菌与油菜茎基溃疡病菌阴性。

表4 含IAC的多重实时荧光PCR方法的应用

3 讨 论

本研究采用含有扩增内标的十字花科细菌性黑斑病菌和油菜茎基溃疡病菌的多重实时荧光PCR方法,在20.0 μL体系中加入1.114×103拷贝数的IAC时,对十字花科细菌性黑斑病菌和油菜茎基溃疡病菌的检测灵敏度和实际样品的扩增效率均不受影响,且能够有效指示PCR反应的假阴性。

在反应过程中低同源性可以使PCR产物不会通过互补链的结合而交联在一起,因此要求构建扩增内标时其与目的基因片段之间的同源性尽量低,从而降低IAC对检测灵敏度的影响[23]。本研究人工构建一段随机序列作为扩增内标,将其在NCBI中进行比对,没有出现与之同源的DNA片段。另外,为获得添加IAC的最佳反应体系,本研究设置了一系列梯度浓度的内标进行试验分析,最终确定反应体系中添加内标的最佳拷贝数为1.114×103;当内标添加量较高时,即添加拷贝数高于1.114×104/μL时,PCR反应灵敏度降低,推测是在同一个PCR反应体系中,当内标添加量高时,由于PCR的偏好性,优先与引物结合,导致目标基因扩增受抑制,从而降低PCR反应的灵敏度。通过与国家标准[25-26]推荐的单重实时荧光PCR方法的灵敏度比较表明,本研究对十字花科细菌性黑斑病菌和油菜茎基溃疡病菌的检测灵敏度分别为6.9×10-4和1.6×10-4ng/μL,均与单重实时荧光PCR方法的检测灵敏度相当。

本研究还发现,当目标菌浓度过高时,IAC受到抑制,没有扩增,但此时目标菌浓度高,很容易被检出,这种情况下IAC的扩增并不重要,因为只有在目标菌与IAC的扩增均受到抑制的情况下,才能判定检测结果为假阴性。索标等[24]与李雪玲等[17]也在研究中观察到了此类现象,体系中目标菌浓度过高时,由于偏好性会抑制IAC的扩增,但这种情况不能判定为假阴性。

对52批实际样品进口油菜籽和十字花科蔬菜种子的检测验证中,本研究建立的多重实时荧光PCR方法与单重实时荧光PCR方法的结果一致。但是对编号10和编号39的样品第一次检测结果对靶标基因和IAC均为阴性,重复试验检测结果显示,编号10的样品十字花科细菌性黑斑病菌为阳性,因此,相比于单重实时荧光PCR方法,本研究建立的多重实时荧光PCR方法可以有效指示假阴性检出结果,避免因核酸提取质量或人工操作失误对试验结果带来的影响,有效提高了检测结果的准确性。

4 结 论

本研究建立的含扩增内标的多重实时荧光PCR检测方法满足同时检测上述细菌性黑斑病菌和油菜茎基溃疡病菌的检测需求,有效缩短检测时间和检测成本,且能够同时指示假阴性,该方法特异性强、灵敏度高、重复性好、稳定性强,能够满足快速、精准、稳定的鉴定需求,为该病原菌的检疫及防控提供有力支撑,对防控病菌传入、保障引种安全具有重要意义。