苹果叶释放挥发性有机物成分及变化规律

李绣宏,郑家银,李少宁,鲁绍伟,赵 娜,徐晓天,杨新兵

(1. 河北农业大学林学院,河北 保定 071000;2. 北京市农林科学院林业果树研究所/北京燕山森林生态系统定位观测研究站,北京 100093)

【研究意义】植物源挥发性有机物(Biogenic volatile organic compounds,BVOCs)是伴随植物生理活动释放到大气环境中,用来抵御外界干扰,促进植物间信息交流,使植物正常生长发育的次生代谢物[1],释放量约占全球年VOCs总释放量的91.7%,主要由异戊二烯、单萜烯和倍半萜烯等组成,成分种类丰富,已发现1万种以上[2-4]。有些BVOCs香气怡人,是医药品和食品合成原料,具有保健医疗、杀菌消毒、净化空气、增强人体健康、缓解疲劳、达到防病治病目的等作用[5-6];也有些BVOCs会对环境产生一些负面影响,但植物释放的含量较低[7-8]。目前,BVOCs的研究对象主要为园林绿化树种和芳香草本植物等[9],而经济林作为林业生态体系重要组成部分,种植面积逐年增加,约占林业总面积的20%和人工林种植面积的58.3%[10],对其释放的BVOCs成分和释放特征研究相当匮乏。苹果(Malusdomestica)是蔷薇科苹果属落叶乔木,作为常见经济林果树,其果实是农业部确定的 11 种优势农产品之一,果皮一般呈红色,果肉富含糖类、矿物质、维生素、多酚等活性物质[11]。在世界各个温带地区广泛栽培,中国作为世界上最大的苹果生产国,其栽培面积和产量均居世界首位,据联合国粮农组织统计,在2019 年中国拥有222.33×108hm2苹果种植面积,占全球苹果产量50%以上[12]。【前人研究进展】目前对苹果释放BVOCs研究主要通过顶空固相微萃取技术(HS-SPME) 结合气质联用(GC-MS) 检测其果实香气BVOCs成分,客观评价果实风味和商品价值,用于改良和培育出香味更受人喜爱的品种[13]。【本研究切入点】在整个生长季,苹果叶释放的BVOCs所产生的生态效益和经济效益常被忽略。已有研究发现苹果叶本身具有凉血解毒,润肠通便等药用价值,能够增强记忆力,加快新陈代谢[14-16]。苹果叶也富含具有抗氧化、抑菌活性物质的多酚[17-18],该化合物能降低退行性疾病如癌症、心脑血管疾病等发生的风险[19-20],而苹果叶多酚含量高于苹果果实和苹果渣等产品[21],但在自然状态下苹果叶释放BVOCs成分及时间变化规律尚未有文献报道。【拟解决的关键问题】本研究采用动态顶空采集法与自动热脱附-气相色谱/质谱联用技术(TCT-GC/MS)对苹果叶片释放的BVOCs成分及生长季(4—10月)变化规律进行研究,综合分析其释放的有益BVOCs成分,以期为苹果叶释放BVOCs成分的利用提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

选择“嘎啦”苹果品种(MalusdomesticaBorkh.cv. Gala)为供试树种,“嘎啦”苹果是我国苹果中最主要的早熟品种,果实鲜艳、肉质金黄、酸甜适口,耐贮藏且容易管理,深受消费者喜爱[22]。树高(3.22±0.21)m,胸径(7.51±0.05)cm,冠幅(3.53±0.18)cm,树龄15年。样株生长于北京市顺义区高丽营试验基地(116°29′41″ E,40°11′08″ N),该地处于首都经济开发区和温榆河绿色生态走廊的延展区域,属暖温带半湿润大陆性季风气候,四季分明。年平均温度11.5 ℃,年均降水量610 mm,其中夏季占全年降雨量的3/4,土壤类型为黄棕壤土。

1.2 研究方法

1.2.1 BVOCs采集方法 于2021年4—10月中下旬选择晴朗无风或微风天气,月变化采样时间为10:00—11:00,每月日变化采样时间为8:00—18:00;每隔2 h进行一次苹果叶释放BVOCs采集,其中4月由于天气原因未进行苹果叶释放BVOCs的采集。利用由大气采样器(QC-1S型号,北京市劳动保护科学研究所产)、解析管[Tenax GR(60/80)目不锈钢热解析管,CAMSCO公司产]、硅胶管、密封袋(50 cm×70 cm)和250 mL干燥塔组成的采集装置对每个单株高度在1.5 m以上向阳背风中部的叶片进行采集,采集气体时流保持在0.20 L/min,每次采样时间为25 min,同一时间点重复3次采样。

1.2.2 BVOCs分析条件 采集的样品通过自动热脱附-气相色谱/质谱联用仪(Thermal Desorption Cold Trap-Gas Chromagraphy/Mass Spectrum,TCT-GC/MS)进行检测。自动热脱附工作条件:解析管在热脱附解析装置260 ℃温度下解析5 min,解析出的BVOCs被吸附到冷阱中,并利用液氮冷却至-25 ℃后,冷阱以40 ℃/s 的速度逐渐升温至300 ℃,解析出的BVOCs经传输线(250 ℃)进入到气相色谱中进行分离分析。气相色谱工作条件:以高纯氦气为载气,流速为1.0 mL/min;色谱柱按程序控制升温,起始温度为40 ℃,保持2 min,然后以4 ℃/min 的速度升至160 ℃,保持2 min,再升温至270 ℃并保持3 min。质谱工作条件:采用电子轰击源EI(70 eV),扫描范围29 ～ 350 m/z,接口温度250 ℃。

1.3 数据处理

经GC/MS分析获得原始数据-总离子流图(Total ion current,TIC),图中出现各峰值经TurboMass Ver 5.4.2版本软件分析、Nist 2008 Library标准谱库检索,去除杂质峰,进行核对和确认,获得BVOCs中英文名称、分子式、CAS号和峰面积等信息。相对含量采用峰面积归一化方法进行计算,公式如下:

式中,C1为BVOCs的相对含量(%),A1为BVOCs离子峰面积,A总为BVOCs峰面积总和。处理后数据用Excel 2020、WPS 2019 和 Origin 2018 软件完成图表的绘制。

2 结果与分析

2.1 苹果叶释放BVOCs组分及生长季动态变化

2.1.1 苹果叶释放BVOCs组分类别生长季动态变化 在整个生长季(4—10月),苹果叶共检测出烷烃类(56)、烯烃类(40)、芳香烃类(34)、酯类(29)、醛类(13)、有机酸类(20)、酮类(14)、醇类(48)、酚类(7)、醚类(5)、酰胺类(25)和其他类(4),总计12类295种BVOCs成分(图1)。不同月份的各组分总数量为9月(113)>5月(100)>6月(70)=7月(70)>8月(67)>4月(45)>10月(20)。

所有BVOCs相对含量为平均值。图中横坐标代表不同BVOCs,1～56为烷烃类,57～96为烯烃类,97～130为芳香烃类,131～159为酯类,160～172为醛类,173～192为有机酸类,193～206为酮类,207～254为醇类,255～261酚类,262～266为醚类,267～291为酰胺类和292～295为其他类。The relative content of all BVOCs is average.The horizontal coordinate in the figure represents different BVOCs, 1-56 are alkanes, 57-96 are alkenes, 97-130 are aromatic hydrocarbons, 131-159 are esters, 160-172 are aldehydes, 173-192 are organic acids, 193-206 are ketones, 207-254 are alcohols, 255-261 are phenols, 262-266 are ethers, 267-291 are amides and 292-295 are others.图1 苹果叶在生长季释放BVOCs组分数量统计Fig.1 Statistics of BVOCs components released from leaves of M. domestica in growing season

如图2所示,苹果叶主要释放烷烃类、烯烃类、芳香烃类、酯类、醛类和醇类BVOCs,其他类各个月份均未超过10%,释放BVOCs类别相对含量和数量各月份之间差异极大。4月苹果叶释放BVOCs类别相对含量前3分别为烯烃类(39.43%±8.49%)、芳香烃类(18.98%±3.65%)和酯类(13.47%±1.64%),数量则是烷烃类(10)、芳香烃类(8)、烯烃类(6)和醇类(6);5月苹果叶释放BVOCs类别相对含量前3分别为芳香烃类(39.35%±1.47%)、烷烃类(19.70%±1.32%)和酯类(8.88%±2.20%),数量则是芳香烃类(27)、烷烃类(18)、烯烃类(10)和醇类(10);6月苹果叶释放BVOCs相对含量前3分别为烷烃类(32.54%±5.51%)、酯类(24.54%±9.09%)和烯烃类(20.11%±3.39%),数量则是烷烃类(13)、烯烃类(13)和醇类(9);7月苹果叶释放BVOCs相对含量前3分别为烯烃类(27.82%±5.12%)、酯类(21.01%±4.97%)和烷烃类(15.93%±4.05%),数量则是烯烃类(11)、醛类(11)和醇类(10);8月苹果叶释放BVOCs相对含量前3分别为烷烃类(32.26%±2.97%)、烯烃类(29.58%±6.31%)和醛类(12.78%±1.17%),数量则是烷烃类(15)、烯烃类(11)和醇类(11);9月苹果叶释放BVOCs相对含量前3分别为烷烃类(33.15%±3.36%)、烯烃类(24.76%±2.93%)和酯类(13.39%±1.84%),数量则是烷烃类(25)、烯烃类(17)、酯类(15)和醇类(15);10月苹果叶释放BVOCs相对含量前3分别为烷烃类(52.14%±10.62%)、醇类(22.30%±8.88%)和酯类(5.98 %±2.20%),数量则是烷烃类(4)、酯类(4)、有机酸类(3)和醇类(3)。

图2 苹果叶释放各类BVOCs相对含量和数量月变化Fig.2 Monthly variation in relative content and quantity of various BVOCs released from leaves of M. Domestica

总体来看,除4月外,烷烃类BVOCs每月相对含量较高,保持在15%以上,尤其在10月,相对含量超过50%;烯烃类BVOCs在4月相对含量最高,6—9月相对含量较高,保持在20%以上;烯烃类BVOCs在5月和10月为谷值时,芳香烃类BVOCs和醇类BVOCs分别在5月和10月达到最高值;酯类BVOCs在整个生长季(4—10月)变化趋势呈近“倒V型”,在4—6月波动上升,6月达到最高值后波动下降,10月达到最低值;不同月份苹果叶释放主要BVOCs成分存在显著差异,其中有益BVOCs成分占比较高。

2.1.2 生长季苹果叶释放BVOCs有益成分动态变化 由表1可知,苹果叶共检测出烯烃类(19)、芳香烃类(3)、酯类(4)、醛类(6)、有机酸类(1)、酮类(1)、醇类(5)和酰胺类(1)8类40种有益BVOCs成分。苹果叶每月释放总有益BVOCs相对含量和数量上均存在明显差异(图3)。有益BVOCs总相对含量变化趋势呈“低—高—低”,在4月和7月出现两个峰值,分别为49.46%、54.00%,两个谷值出现在5月和10月,分别为22.46%和8.57%;苹果叶释放BVOCs有益组分生长季总数量大小排序为9月(21)>6月(17)=7月(17)>8月(15)>5月(14)>4月(10)>10月(3),变化趋势呈“M”型。将4—5月划分为春季,6—8月划分为夏季,9—10月划分为秋季,可知苹果叶有益组分总相对含量为夏季(47.59%)>春季(35.96%)>秋季(23.13%)。

表1 苹果叶释放的有益BVOCs组分及相对含量月变化

图3 苹果叶释放的总有益BVOCs数量和相对含量月变化Fig.3 Monthly variation of the total quantity and total relative content of beneficial BVOCs from leaves of M. domestica

不同月份苹果叶释放有益BVOCs具体成分各有不同,释放烯烃类、酯类、醛类和醇类BVOCs较多。 4月苹果叶以释放对薄荷-1(7),3-二烯(20.79%)、α-蒎烯(12.73%)和右旋萜二烯(4.98%)等有益烯烃类BVOCs为主;5月苹果叶主要释放有益BVOCs为酯类、酸类和醛类,乙酸乙酯(6.15%)、醋酸(4.90%)和己醛(3.26%)相对含量位列前3;6月苹果叶释放有益烯烃类BVOCs代替酸类和醛类,与酯类成为主要释放的有益BVOCs类别,以释放乙酸乙酯(21.11%)、罗汉柏烯(11.77%)和3-蒈烯(5.40%)为主;7月苹果叶主要释放有益BVOCs类别与6月一致,但主要释放BVOCs成分存在变化,α-蒎烯(12.91%)相对含量明显增加;8月苹果叶除主要释放有益BVOCs为烯烃类和酯类外,醛类释放的相对含量明显增加,以释放α-蒎烯(21.53%)、乙酸乙酯(4.38%)和庚醛(2.25%)为主;9月苹果叶释放的有益醛类BVOCs基本消失,以释放烯烃类和酯类为主,罗汉柏烯(10.40%)、α-蒎烯(7.59%)和丙酸芳樟酯(7.39%)相对含量较高;10月苹果叶释放的有益醛类BVOCs与9月相比出现回弹,以释放3-蒈烯(4.37%)、天然壬醛(4.02%)和乙酸乙酯(0.18%)为主。由此可知,在生长季(4—10月)苹果叶主要释放有益BVOCs成分为对薄荷-1(7),3-二烯、α-蒎烯、罗汉柏烯、3-蒈烯、右旋萜二烯、乙酸乙酯、丙酸芳樟酯、己醛、庚醛、天然壬醛和醋酸。

2.2 苹果叶在生长季BVOCs组分日变化

2.2.1 不同月份苹果叶释放BVOCs组分类别日变化 如图4所示,在生长季(5—10月)一天08:00—18:00中,苹果叶以释放烷烃类、烯烃类、芳香烃类、酯类、醛类和醇类BVOCs为主,但各时间点各类BVOCs相对含量和数量各有不同,其相对含量高不等于数量多;随时间的变化,苹果叶主要释放BVOCs类别出现更替现象,在夏季尤为突出,例如苹果叶释放有机酸类和醛类BVOCs相对含量在夏季下午出现明显增加,代替烯烃类BVOCs成为主要释放BVOCs类别;苹果叶释放各类BVOCs相对含量在到达峰值后,随之出现明显下降,其变化趋势多呈“低—高—低”、“V”型、倒“V”型、“N”型、“M”型和“W”型。各月苹果释放的烷烃类BVOCs相对含量最高值一般在08:00、12:00和18:00,整体表现为上午<下午,在10月12:00相对含量达到最高(49.70%±8.11%);烯烃类BVOCs相对含量均表现为上午>下午,在5月12:00相对含量达到最高(49.57%±12.39%);芳香烃类BVOCs相对含量最高值一般在08:00,其中在8月8:00相对含量达到最高(21.35%±1.42%);酯类BVOCs相对含量一般表现为上午<下午,在5月18:00达到最高值(53.36%±10.53%);醛类BVOCs相对含量最高值(25.61%±1.79%)在8月14:00,其中,春季整体表现为上午>下午,而在夏季和秋季相对含量最高值一般在14:00和16:00,整体表现为上午<下午;有机酸类BVOCs相对含量除在6月16:00到达整个生长季的最大值(39.84%±12.11%),其次在7月12:00达到21.86%±5.78%外,在其他月份相对含量不占优势,保持在10%以下;醇类BVOCs相对含量在各月出现最高值的时间点比较随机,相对含量最大值一般在下午,其中在5月14:00达到最高值(50.76%±9.65%),随后大幅下跌。苹果叶释放的BVOCs总数量在春季(5月)10:00达到最大值(86);在夏季除了8月在上午(8:00)释放的BVOCs数量最多(92)外,其他月份均为下午最多,其中苹果叶在6月18:00释放BVOCs最多(103),而7月则是14:00(121);苹果叶秋季释放的BVOCs总数量均在12:00最多,其中9月释放的BVOCs数量最多为86。

图4 5—10月苹果叶释放BVOCs类别和相对含量日变化Fig.4 Daily variation of BVOCs category and relative contents released from leaves of M. domestica from May to October

2.2.2 苹果叶有益BVOCs组成日变化 在生长季(5—10月)一天内的不同时段,苹果叶释放的有益BVOCs由烯烃类、芳香烃类、酯类、醛类、有机酸类、醇类和酰胺类共7类BVOCs组成,总相对含量和数量5—10月整体随月份变化呈波动下降趋势(图5)。苹果叶释放总相对含量和组分数量释放高峰期会出现在一天(08:00—18:00)内各个时间点,在夏季出现高峰期后移现象,即BVOCs相对含量和组分数量最大值一般出现在下午。5月日变化各个时间点苹果叶释放有益BVOCs相对含量与其他月份相比,处于前列,尤其是在12:00和16:00出现有益BVOCs两个峰值,相对含量分别为72.79%和74.66%;苹果叶释放有益BVOCs数量最多的时间点出现在7月,数量变化趋势呈近倒“V”型,一天中不同时间点总数量大小排序为14:00(26)>12:00(23)>16:00(20)>10:00(18)=08:00(18)>18:00(13)。苹果叶主要释放有益BVOCs成分包括α-蒎烯、对薄荷-1(7),3-二烯、(1R)-(+)-α-蒎烯、3-蒈烯、罗汉柏烯、α-柏木烯、邻伞花烃、乙酸乙酯、乙酸叶醇酯、顺-3-己烯-1-醇、天然壬醛、己醛和醋酸。

气泡直径大小代表相对含量大小。The bubble diameter represents the relative content.图5 苹果叶释放有益BVOCs日变化气泡图Fig.5 Bubble chart of daily variation of beneficial BVOCs released from leaves of M. domestica

3 讨 论

在整个生长季,苹果叶释放的BVOCs成分复杂,种类繁多,释放种类数量有2个峰值,分别在5月(100)和9月(113)。李双江[9]检测出夏季(7月)和秋季(9月)苹果叶释放的BVOCs的主要类别与本研究类似,但其BVOCs组成成分数量只检测出42种,远小于本研究在夏季(7月)和秋季(9月)检测出释放种类数量。目前,估算某一植物BVOCs排放量常用异戊二烯、单萜烯和倍半萜烯的总释放量进行替代[4],本研究研究发现苹果叶有较强的单萜烯释放能力,但在整个生长季并未发现苹果叶释放异戊二烯,根据现有研究可知,苹果叶在夏季和秋季会释放少量异戊二烯,有时会接近0,单萜烯释放量是其10～300倍[23],与此类似的还有香樟(Cinnamomumcamphora)[6]。

树木的BVOCs释放呈明显的季节性变化和日变化特征。春、夏和秋季节是BVOCs释放的3个主要季节,从释放情况来看,春、夏、秋季中的任何月份都可能成为某一树木平均释放速率最高的时期[24]。本研究中苹果叶释放烯烃类相对含量整体表现为春季>夏季>秋季,与王金凤等[25]对春、夏、秋和冬 4 个季节木荷(Schimasuperba)枝叶 BVOCs 的成分组成和相对含量进行了比较,发现BVOCs 种类数量在春季(3月)最多,且萜烯类BVOCs相对含量最高的结论类似。而在不同季节、不同月份,树木释放BVOCs速率一般上午低于下午[26],但也存在上午高于下午的情况,例如李双江等[9]通过对梨树(Pyruscommunis)和柿子(Diospyroskaki)研究发现,上午(9:00—11:00)总BVOCs(异戊二烯、单萜烯和倍半萜烯)的释放速率高于下午(15:00—17:00),本研究中烯烃类BVOCs释放日变化特征得到了相似的结论,而导致这情况出现的主要原因要可能是温度;温度能影响单萜烯相应合成酶的活性,随着温度的升高,两者的合成速率增大,一般温带和热带植物温度阈值为30～40 ℃,但温度超过一定限度时,植物单萜烯的释放速率则会受到一定程度的抑制,当温度超过合成酶的耐受值时失活[27-28];北京地区春季气温一般保持在20 ℃左右,有利于植物释放单萜烯类BVOCs[29], 而夏季气温较高,尤其是在12:00后,气温常超过35 ℃,导致苹果叶单萜烯类BVOCs相对含量表现为上午>下午。

随着对植物释放BVOCs研究的深入,发现某些BVOCs具有抗生性、抗菌性和抗癌性等医疗保健功效,常作为医药原料[1],特别是萜类(单萜烯、倍半萜烯和双萜)能够解除疲劳、调节精神和刺激生长激素的分泌。以此开展了对多种园林绿化树种释放有益BVOCs的研究,并为植物资源的综合开发利用提供了重要的参考依据,例如桉树(Eucalyptusrobusta)、黄连木(Pistaciachinensis)、油松(Pinustabuliformis)和法桐(Platanusorientalis)等释放的萜稀类BVOCs经嗅闻后进入肺部可杀死致病菌(白喉、痢疾和结核等),减轻肺部出现炎症情况[30-31]。基于前人的研究发现植物释放的有益BVOCs以烯烃类为主,本研究中除10月外,苹果叶释放有益BVOCs的相对含量均保持在20%以上,尤其在春季(5月)12:00和16:00苹果叶释放有益BVOCs相对含量超过70%,种类数量较丰富,在这个时间点苹果林能达到类似于森林康养和森林浴的效果,从化学生态学角度来看,苹果叶释放的有益BVOCs在抑菌、消炎和抗氧化等方面有较高的应用前景。

4 结 论

在整个生长季(4—10月),苹果叶共检测出12类295种BVOCs,以烷烃类(56)、烯烃类(40)、芳香烃类(34)、酯类(29)、醛类(13)和醇类(48)为主,占总BVOCs相对含量80%以上,组分总数量9月(113)>5月(100)>6月(70)=7月(70)>8月(67)>4月(45)>10月(20)。苹果释放BVOCs组分存在较明显的季节性变化特征和日变化特征,尤其是烯烃类BVOCs月变化表现为4月和9月为峰值,5月和10月为谷值,日变化表现为上午>下午,其相对含量下降后,主要释放的其他类BVOCs会出现明显上升。苹果是释放有益BVOCs较强的树种,共检测出8类40种有益BVOCs,在5月12:00和16:00出现同时间点的最大值,均超过70%;从整体来看,苹果叶释放有益BVOCs相对含量在夏季最高(47.59%),随时间增加整体呈波动下降趋势;苹果叶释放有益BVOCs成分以α-蒎烯、对薄荷-1(7),3-二烯、3-蒈烯、罗汉柏烯、乙酸乙酯、(1R)-(+)-α-蒎烯、右旋萜二烯、α-柏木烯、邻伞花烃、丙酸芳樟酯、乙酸叶醇酯、顺-3-己烯-1-醇、庚醛、天然壬醛、己醛和醋酸为主。