黄色芽叶茶树新品种黄金芽自然杂交后代的生化品质分析

杨 春,梁思慧,陈正武,陈 娟,李 燕,乔大河,郭 燕,张小琴

(贵州省农业科学院茶叶研究所,贵阳 550006)

【研究意义】茶树原产于中国,作为多年生常绿木本饮料作物,在世界范围内广泛引种[1]。茶树品种是茶叶产品风味品质表现的基础,白化类茶树品种因其加工成的茶叶产品外形独特、品质优异,备受市场追捧[2]。黄金芽作为光照敏感型黄色芽叶白化类茶树品种,在国内多个省份均有引种[3-7],但其白化特性使其在强光照下易出现日灼症状,存在一定的生长障碍[8]。对于黄金芽品种普遍存在的产量较低、适制性窄和不耐低温、强光照等生长障碍,利用资源圃复杂的遗传背景,从其自然杂交种子后代中选育目标新品种,是一种有效的品种本地化改良方式。【前人研究进展】茶树是典型两性花、异花授粉植物,存在自然突变[9]。因此,茶树种子作为天然杂合体是良好的品种改良材料[10],浙农901[11]、浙农902[12]和湘茶研12号[13]等茶树新品种均选自优良母本的自然杂交种子后代。咖啡碱、儿茶素和茶氨酸等特征性生化成分不仅赋予茶叶独特的风味品质,也是茶叶发挥保健功能的关键物质[14]。因此,生化品质评价是茶树品种选育中的一项重要内容。陈潇敏等[15]从24份大田茶树资源中筛选出EGCG、咖啡碱和茶氨酸含量较高的资源分别为5、1和6份;董方等[16]从28份江西茶树资源中筛选出2份高咖啡碱资源;杨春等[17-18]先后从115份贵州地方茶树种质资源中筛选出高茶氨酸资源3份,高EGCG资源6份。主成分分析法与聚类分析相结合的综合评价方法是评价茶树生化品质的良好手段,尤其是在评价茶树自然杂交后代和地方群体资源的生化品质研究中得到广泛应用[19-21]。【本研究切入点】黄金芽作为引种范围较广的黄色芽叶茶树新品种,有研究报道,通过适当遮阳或改善生长环境等方法可降低日灼对其生长发育的影响[22-23],但通过自然杂交手段改良黄金芽品种的研究鲜有报道,且其自然杂交后代的生化品质评价也未见相关报道。【拟解决的关键问题】利用高效液相色谱法检测111份黄金芽自然杂交后代的咖啡碱、茶氨酸及儿茶素组分等茶树特征性生化组分,结合相关性分析、主成分分析和聚类分析等方法对其生化性状进行综合分析评价,探明黄金芽自然杂交后代的生化品质变化特征,以期为特异叶色茶树品种黄金芽的系统鉴定、本地化品种改良和开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 茶树 111份黄金芽自然杂交后代,均为同一母本黄金芽茶树上采集的种子播种后长成的单株;各单株均为6年生成龄茶树,取自贵州省茶叶研究所湄潭茶树种质资源圃。

1.1.2 仪器 Agilent 1260 Infinity II 液相色谱仪,G1314F紫外检测器,美国安捷伦公司生产。

1.1.3 试剂 儿茶素组分(EGC、C、EC、EGCG和ECG)、咖啡碱和没食子酸标准品购自北京世纪奥科生物技术有限公司;GCG和茶氨酸标准品购自合肥博美生物科技有限公司;N,N-二甲基甲酰胺、乙腈、甲醇和冰醋酸等有机试剂,为市售HPLC级。

1.2 方法

1.2.1 样品采集与预处理 依据不同材料萌发期不同,于春季按一芽2叶留鱼叶的标准采摘鲜叶原料,并采用微波杀青的方法[24]制备生化检测样。

1.2.2 生化成分的含量测定 测定111份黄金芽自然杂交种子后代单株的咖啡碱、茶氨酸、没食子酸和儿茶素组分(EGC、CEC、EGCG、GCG及ECG)含量。①咖啡碱、没食子酸及儿茶素组分含量测定。茶汤采用70%甲醇浸提,并参照周顺珍等[25]的方法采用高效液相色谱仪搭配紫外检测器检测。检测色谱条件:色谱柱 Hypersil ODS2(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相,A相超纯水,B相[v(N,N-二甲基甲酰胺)∶v(甲醇)∶v(冰醋酸)=40∶2∶1.5]。梯度洗脱:0～13 min,B相由14%线性升至23%;13～22 min,B相由23%线性升至34%;22～28 min,B相保持34%;28～30 min,B相由34%线性降至14%;30～35 min,B相保持14%至结束。流速1.0 mL/min,检测波长278 nm,柱温35 ℃,进样量5 μL。②茶氨酸含量测定。茶汤采用沸水浸提法浸提,参照岳婕等[26]的方法采用高效液相色谱仪搭配紫外检测器检测。检测色谱条件:色谱柱 Hypersil ODS2(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相,A相为2.1 g SDS+0.71 mL磷酸,超纯水定容至500 mL;B相为100%乙腈,vA∶vB=68∶32,等梯度运行15 min;流速1.0 mL/min,检测波长203 nm,柱温40 ℃,进样量10 μL。每个样品测定3次,取平均值。

非酯型儿茶素(Non-estercatechins)=EGC+EC+C

酯型儿茶素(Estercatechins)=EGCG+GCG+ECG

儿茶素总量[18](Totalcatechins)=非酯型儿茶素+酯型儿茶素。

H′=-∑Pi·lnPi

式中,Pi为各级别的个体数与总个体数比值。

1.3 数据统计与分析

采用Excel 2010进行数据统计,并采用SPSS 21.0进行主成分分析、Person相关性分析和差异显著性检验,TBtools进行聚类分析和热图绘制[28]。

2 结果与分析

2.1 111份黄金芽自然杂交后代材料的生化指标含量与其遗传多样性

2.1.1 生化成分含量 从表1看出,111份黄金芽自然杂交后代的咖啡碱含量为2.99%～4.40%,平均为3.67%;茶氨酸含量为0.83%～2.85%,平均为1.93%;没食子酸含量为0.02%～0.42%,平均为0.05%;EGC含量为0.47%～3.63%,平均为1.70%;C含量为0.10%～0.38%,平均为0.18%;EC含量为0.34%～1.51%,平均为0.63%;EGCG含量为5.16%～10.40%,平均为8.16%;GCG为0.00%～0.34%,平均为0.05%;ECG含量为1.10%～4.62%,平均为2.33%;非酯型儿茶素含量为1.30%～4.32%,平均为2.51%;酯型儿茶素含量为6.83%～14.37%,平均为10.49%;儿茶素总量为9.13%～16.95%,平均为13.06%。

表1 12个生化指标含量与其遗传多样性指数

2.1.2 遗传多样性 (1)变异系数。12个生化性状变异系数为8.47%～126.53%,平均为34.90%,依次为GCG>没食子酸>ECG>EGC>C>EC>非酯型儿茶素>茶氨酸>酯型儿茶素>EGCG>儿茶素总量>咖啡碱,其中,GCG最大,没食子酸(82.91%)其次,咖啡碱的变异系数(8.47%)最小且在12个生化指标中最小,EGCG的变异系数(13.37%)在6个儿茶素组分中最小。说明茶树有性杂交群体后代中咖啡碱是遗传较稳定的生化组分,EGCG是儿茶素类化合物中遗传相对较稳定的组分。

(2)遗传多样性指数。12个生化性状的遗传多样性指数为0.983～2.088,平均为1.896,依次为咖啡碱>酯型儿茶素>儿茶素总量>EGCG>EGC>ECG>茶氨酸>非酯型儿茶素>C>EC>GCG>没食子酸,其中,咖啡碱最大,酯型儿茶素(2.057)其次,没食子酸最小。咖啡碱、酯型儿茶素、儿茶素总量、EGCG、EGC和ECG的遗传多样性指数依次为2.088、2.057、2.055、2.036、2.012和2.002,均大于2.0,表明黄金芽自然杂交后代生化性状变异丰富,是良好的品种改良替换材料。

2.2 黄金芽后代的生化品质评价

2.2.1 相关性分析 由表2可知,茶树生化性状间相关性较强,12个生化性状的66对相关系数有36对呈显著或极显著相关。没食子酸与其他生化性状间的相关性均不显著。咖啡碱与EGCG、ECG、酯型儿茶素和儿茶素总量呈极显著正相关,相关系数分别为0.394、0.357、0.460和0.386;咖啡碱与茶氨酸呈显著负相关,与其余指标相关性不显著。茶氨酸与其他11个生化性状均呈负相关性,其中,与咖啡碱、EC和非酯型儿茶素呈显著负相关,相关系数分别为-0.212、-0.228和-0.190;茶氨酸与EGCG、ECG、酯型儿茶素和儿茶素总量呈极显著负相关,相关系数分别为-0.282、-0.414、-0.402和-0.430。儿茶素指标间存在较强的相关性,9个儿茶素类指标的36对相关系数有25对呈极显著正相关,1对呈显著正相关。其中,EGC与非酯型儿茶素和儿茶素总量均呈极显著正相关,相关系数分别为0.943和0.293;C与EC、EGCG、GCG、ECG、非酯型儿茶素、酯型儿茶素和儿茶素总量均呈极显著正相关,相关系数分别为0.489、0.313、0.468、0.370、0.288、0.422和0.481;EC与GCG、ECG、非酯型儿茶素、酯型儿茶素和儿茶素总量均呈极显著正相关,相关系数分别为0.261、0.496、0.387、0.296和0.400;EGCG与GCG、ECG、酯型儿茶素和儿茶素总量均呈极显著正相关,相关系数分别为0.305、0.338、0.884和0.830;GCG与ECG呈显著正相关,相关系数为0.202,与酯型儿茶素和儿茶素总量均呈极显著正相关,相关系数为0.357和0.337;ECG与酯型儿茶素和儿茶素总量均呈极显著正相关,相关系数为0.738和0.699;非酯型儿茶素与儿茶素总量呈极显著正相关,相关系数为0.425;酯型儿茶素与儿茶素总量呈极显著正相关,相关系数为0.942。

表2 12个生化性状间相关系数

2.2.2 主成分分析 从表3～4看出,对111份黄金芽后代12个生化性状进行主成分分析,根据特征值>1的原则提取到5个主成分,其对应特征值分别为4.394、2.145、1.401、1.080和1.005,其累积贡献率达83.541%,包含原始变量的大部分信息。其中,第1主成分贡献率最高,达36.615%,根据各主成分生化因子载荷值可知,第1主成分主要决定因子是儿茶素、酯型儿茶素总量、EGCG和ECG;第2主成分贡献率为17.872%,其主要决定因子为非酯型儿茶素和EGC;第3主成分贡献率为11.678%,主要决定因子为C和EC;第4主成分贡献率为9.003%,主要决定因子为GCG和茶氨酸;第5主成分贡献率为8.373%,主要决定因子为没食子酸。根据各主成分的载荷矩阵及系数(表4)拟合得出5个主成分的线性方程式。

表3 111份黄金芽自然杂交后代材料生化指标的主成分特征值及贡献率

表4 111份黄金芽自然杂交后代材料生化指标的主成分载荷矩阵和系数

F1=-0.024X1+0.101X2-0.112X3+…+0.211X11+0.220X12

F2=-0.133X1-0.196X2-0.008X3+…-0.126X11+0.027X12

F3=-0.118X1-0.254X2+0.255X3+…-0.088X11-0.112X12

F4=0.241X1+0.060X2+0.418X3+…+0.027X11+0.057X12

F5=0.851X1-0.052X2-0.388X3+…-0.117X11-0.079X12

以各主成分的方差相对贡献率为权重,对5个主成分进行加权求和,得出基于12个生化性状计算黄金芽自然杂交后代生化品质得分的综合评价函数(F),并依此得到111份黄金芽自然杂交后代生化品质综合得分及其排序(表5)。其中,大部分材料的F为2.0～3.0,HJY-F1-52、HJY-F1-82、HJY-F1-61和HJY-F1-46是得分较高的材料,F>3.0。除第1主成分(F1)和第4主成分(F4)得分为正值外,其他3个主成分得分均为负值,且第1主成分的得分对综合得分起决定性作用。因此,第1主成分中的决定生化因子儿茶素总量、酯型儿茶素、EGCG和ECG是评价111份黄金芽后代生化品质优劣的关键。

表5 111份黄金芽自然杂交后代的主成分得分和综合得分

F=0.438F1+0.214F2+0.140F3+0.108F4+0.100F5

2.2.3 聚类分析 由图1可知,依据9个茶树特征次生代谢产物可将111份材料聚成4类。其中,第Ⅱ类包含35份材料,主要特点为咖啡碱、EGCG、ECG、酯型儿茶素和儿茶素总量含量较高,茶氨酸含量较低。第Ⅳ类包含5份材料,主要特点是咖啡碱、C、EGCG、酯型儿茶素和儿茶素总量含量较低,茶氨酸含量较高。第Ⅰ类和第Ⅲ类介于二者之间,第Ⅰ类的44份材料在生化性状上接近第Ⅱ类,此2个类群的区别在于,第Ⅰ类的茶氨酸含量显著高于第Ⅱ类,而ECG、酯型儿茶素和儿茶素总量显著或极显著低于第Ⅱ类。第Ⅲ类的27份材料在生化性状上接近第Ⅳ类,此2个类群的区别在于,第Ⅲ类咖啡碱、C、EGCG、酯型儿茶素和儿茶素总量显著或极显著高于第Ⅳ类。从表6可知,4个类群的12个生化性状含量存在差异。其中,没食子酸、EGC和非酯型儿茶素含量在4个类群中均不存在显著差异,其余9个生化性状在4个类群中的分布均存在显著差异。咖啡碱和茶氨酸在4个类群中的含量分布存在明显差异,第Ⅱ类中咖啡碱含量显著高于第Ⅲ类和第Ⅳ类,而茶氨酸含量分布则相反,第Ⅱ类中茶氨酸含量显著低于其他3类;第Ⅳ类中C含量显著低于其他3类,极显著低于第Ⅰ类;EC含量在4个类群间不存在极显著差异,第Ⅱ类中EC含量显著高于第Ⅳ类;4个类群的EGCG含量差异较为显著,第Ⅰ类和第Ⅱ类中EGCG含量不存在显著差异,且极显著高于其他2类,尤以第Ⅳ类EGCG含量最低,极显著低于其他3类;第Ⅱ类ECG含量极显著高于其他3类;酯型儿茶素含量和儿茶素总量均为第Ⅱ类>第Ⅰ类>第Ⅲ类>第Ⅳ类,且各分类间存在极显著和显著的差异性。结合12个生化性状在4个类群的差异表现可知,咖啡碱、茶氨酸、EGCG、酯型儿茶素和儿茶素总量是将111份材料划分为4个类群的主要生化依据。

图1 基于9个生化指标的111份黄金芽杂交后代的聚类图谱Fig.1 Cluster diagram of 111 Huangjinya natural hybrid progenies based on 9 biochemical index

表6 4个类群12个生化性状的含量

3 讨 论

111份黄金芽自然杂交后代的12个生化性状变异系数平均为34.90%,咖啡碱的变异系数(8.47%)在12个生化指标中最小,EGCG的变异系数(13.37%)在6个儿茶素组分中最小,此结果与张金霞等[19,29]的研究结果一致,说明茶树有性杂交群体后代中咖啡碱是遗传较稳定的生化组分,EGCG是儿茶素类化合物中遗传相对较稳定的组分。111份黄金芽自然杂交后代的遗传多样性指数平均为1.896,数值与江西[30]、浙江[31]、云南[32]等地的地方茶树资源相当,说明茶树的自然杂交后代在生化成分上存在丰富的多样性和变异,可作为茶树新品种选育的优质材料加以利用。

茶氨酸和EGCG是茶树的特征性次生代谢产物[14]。以茶氨酸为代表的氨基酸类物质与茶树氮代谢密切相关[33],而以EGCG为代表的多酚类物质与茶树碳代谢密切相关[34]。本研究中茶氨酸与9个儿茶素类物质均呈负相关,且与其中的4个主要儿茶素指标呈极显著负相关。已有研究发现,氨基酸类物质与多酚类物质间存在负相关性[35-38]。本研究结果证实,茶树中的碳氮代谢存在拮抗平衡,表现在生化因子上则是氮代谢主导的氨基酸类物质与碳代谢主导的多酚类物质间存在负相关性。

主成分分析作为一种简化多指标的降维多元统计方法,已广泛应用于豇豆[39]、桄榔[27]等多个作物品质评价中,茶树生化品质评价中同样应用广泛。张金霞等[19]的研究发现,130份黄山种自然杂交后代的14个生化性状可提取4个主成分,其中,第1主成分中儿茶素总量、酯型儿茶素、EGCG、GCG和ECG是主要贡献因子。莫岚等[40-42]的研究发现,儿茶素总量、酯型儿茶素和EGCG等主要儿茶素类指标是评价茶树种质生化品质的主要贡献因子。本研究结果同样证实,儿茶素总量、酯型儿茶素、EGCG和ECG是决定111份黄金芽后代生化品质综合得分的关键生化因子。上述研究说明,EGCG和ECG等儿茶素类指标是决定茶树种质生化品质的关键。

4 结 论

黄金芽自然杂交后代单株的12个生化性状具有丰富的遗传多样性,其平均变异系数为34.90%,平均遗传多样性指数为1.896;主成分分析从12个生化性状中提取出5个主成分,累积贡献率为83.541%,并建立生化性状评价模型:F=0.438F1+0.214F2+0.140F3+0.108F4+0.100F5。结合主成分综合得分,筛选出HJY-F1-52、HJY-F1-82、HJY-F1-61和HJY-F1-46共4份生化性状表现较优(F均>3.0)的茶树种质,可进一步研究育成新品种,开发茶叶新产品。