挥发性风味分析技术及其在传统发酵豆制品中应用研究进展

胡航伟,段秋虹,刘凌霄,张金宝,朱玲,常腾腾,刘云国

(1.郑州科技学院 食品科学与工程学院,郑州 450064; 2.临沂市农业科学院,山东 临沂 276000;3.豆黄金食品有限公司,山东 临沂 273400; 4.临沂大学 生命科学学院,山东 临沂 276000)

大豆(Glycinemax(L.) Merr.)是世界上重要的经济作物之一,由于其优良的产量和丰富的营养物质,已被加工成许多不同种类的豆制品[1-2]。在诸多豆制品加工实践中,微生物发酵是一种简单且廉价的技术,可以显著改善大豆的营养、质地和风味,从而使其成为在全世界范围内流行的消费食品和调味品。传统发酵豆制品由于其独特的风味和改善健康的益处,已成为人们饮食结构中的重要组成部分[3]。在发酵过程中,大豆中的营养物质经过微生物分泌的酶类自然催化而发生一系列生化反应,并伴随着诸多具有功能性和生物活性物质的产生,如生物活性肽、不饱和脂肪酸、游离大豆异黄酮等,使发酵豆制品在营养、风味和健康方面的优势更明显[4-5]。

随着消费者的理念向安全、营养和健康饮食方面转变,传统发酵豆制品仍以其独特的风味和营养功能满足了消费群体日益多样化的饮食需求。本文系统地总结了挥发性风味物质分析的基本思路及相关技术,重点归纳了4种很受欢迎的传统发酵豆制品豆豉、大酱、腐乳和酱油的挥发性风味成分研究状况,旨在为传统发酵豆制品的品质提升、技术创新提供新的思路。

1 挥发性风味物质提取方法

食品中香气物质的相对分子量较小,挥发性较强,而且它们具有成分复杂、含量极少、稳定性差等特点。因此,选择一种合适的提取方法来获取样品中的有效香气成分十分必要。以下几种提取方法已被广泛用于从食品样品基质中提取和浓缩挥发性化合物,包括无溶剂萃取技术和溶剂萃取技术。前者主要是固相微提取、顶空进样、搅拌棒吸附萃取等;后者包括液-液萃取、溶剂辅助风味蒸发和同时蒸馏萃取等[6]。

1.1 顶空固相微萃取

顶空分析主要包括静态和动态顶空分析,通常用于分析无溶剂样品的香气成分。其中,顶空-固相微萃取(headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)是静态顶空最流行的一种技术,它被广泛用于从非挥发性食品基质中快速提取和浓缩挥发物。SPME过程主要包括两个步骤:挥发物从样品基质中“逃逸”并吸附到外部涂有固定相的熔融SiO2纤维中;将吸附物转移到气相色谱(gas chromatography,GC)系统中。动态顶空进样(dynamic headspace sampling,DHS)首先使载气通过液体样品,然后在吸附剂上捕获挥发性分析物,并在GC上发生解吸[7]。与HS-SPME技术相比,DHS特别适合测定各种浓度的挥发性化合物,它具有灵活的采样条件,如平衡温度、吹扫时间等。SPME是目前食品挥发性风味分析中最常用的提取技术之一,在较低温度下(通常在40～60 ℃之间),样品中的挥发性分析物便被直接吸附到纤维涂层中。SPME技术可与GC、气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)等结合使用,具有操作简单、灵敏度高、样品量小、可捕获多种香气化合物的突出优点;缺点是需要温度严格、依靠极性来提取化合物等,污染成分的存在也会对仪器产生一定的负面影响,因此只能用于提取挥发性成分[8]。

1.2 搅拌棒吸附萃取

HS-SPME技术关注于样品表面热孵育处于气态的化合物,并使用吸附剂保证它们被吸附富集。随着提取技术的创新,可将吸附剂直接放置在液态食品样品中,例如搅拌棒吸附萃取(stir bar sorption extraction,SBSE),其能够在搅拌过程中将特定的化合物吸附在涂层上,现已成功应用于食品风味分析的前处理中。相比SPME,SBSE展现出吸附能力强、萃取容量高、固定相体积大、无需外加搅拌子、可避免竞争性吸附、自身搅拌的同时便实现萃取和富集等显著优势[9-10]。

1.3 溶剂辅助风味蒸发

1999年,Engel等[11]报道一种挥发物提取的新方法,称作溶剂辅助风味蒸发(solvent-assisted flavor evaporation,SAFE)。在此方法中,由于高真空(10-2～10-3Pa)蒸发和极低温(-196 ℃)冷阱装置,实现了挥发物的蒸发、提取和冷凝过程在较低温度(<50 ℃)下进行。SAFE技术是一种很好的挥发性萃取技术,它能够从复杂的基质中成功分离挥发性化合物,即使是高沸点的物质,也能够达到较高的回收率。此方法既可避免色素、油脂等成分混入馏出液中,又能够减少氧化或水解产物的生成,也不会对基质中的其他成分(如氨基酸、有机酸和酚酸)产生任何副作用,所收集的萃取物香气自然、纯正,适用于新鲜水果、蔬菜等香气成分的分析[12]。

1.4 同时蒸馏萃取及其他溶剂萃取技术

溶剂萃取是指通过搅拌、混合或离心,将风味化合物从食品基质中转移到有机溶剂或超临界流体中,以分离和富集风味成分,包括液-液微萃取(liquid-liquid microextraction,LLME)、超临界流体萃取(supercritical fluid extraction,SFE)等。其中,同时蒸馏萃取(simultaneous distillation extraction,SDE)与传统的液-液萃取、水蒸气蒸馏萃取不同,能够将挥发物的浓缩与分离相结合。该技术的重复性好、萃取量高,是一种有效的前处理方式。当前,SDE技术在食品分析、香精香料、药物化学、发酵制品等方面的应用广泛[13]。SFE是一种替代传统萃取技术的新手段,它具有萃取效率高、选择性好、无溶剂残留、溶剂密度可调等显著优势[14]。由于其特性类似于气体,超临界流体比液体具有更好的渗透和溶剂能力,进而在待萃取物料中快速扩散。其选择性和溶剂溶解能力可以很容易地通过温度或压力的细微变化来控制[15]。最后,通过释放压力,超临界流体返回到气态并蒸发,留下无溶剂的提取物[16]。因此,通过SFE获得样品中的芳香提取物是可行的。

2 挥发性风味物质组分的鉴定

2.1 气相色谱-质谱联用

MS与GC耦合可以追溯到1959年,该技术很快在各个学科分支中流行,包括食物分析。GC-MS的关键优势在于使用70 eV的电离能,现在几乎所有设备都使用[17]。从而,化合物的裂解以相同的方式发生,这使得能够创建包含多种化合物裂解模式信息的数据库,如NIST文库[18]。考虑到分析的每个阶段都应该减少可能引起结论有用信息的损失,因此,在改进GC-MS方法时,着重关注以下方面:选择合适的色谱柱(一维GC-MS)或一对色谱柱(二维GC×GC-MS)、合适的温度程序、适合样品引入的进样器和MS类型(四级杆、飞行时间、离子阱和串联形式)。其中,飞行时间-质谱技术(time of flight-mass spectrometry,TOF-MS)是自20世纪90年代以来应用最广泛的质谱技术之一。首先,带电离子在电场中通过一定的距离获得固定的动能,然后不同的离子以相同的动能移动一定的距离。由于离子的质荷比不同,它们会显示出不同的漂移时间,以达到分离效果的目的。TOF-MS的优势尤其明显,分辨率高、灵敏度高、检测范围宽,可以在每个采集的数据点以更高的采集频率来收集完整的质谱信息[19]。气相色谱-质谱联用技术在食品挥发物分析中的基本流程[20]见图1。

图1 气相色谱-质谱分析食品中挥发性和非挥发性物质流程图Fig.1 Flow chart of volatile and non-volatile substances in food analyzed by GC-MS

2.2 气相色谱-嗅闻-质谱法

气相色谱-嗅闻-质谱(gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry,GC-O-MS)由GC-O和GC-MS两个工作单元组成,并将二者的特性组合为一个集成仪器,成为研究食品中香气成分的强有力工具[21]。需要注意的是,通常质谱仪在真空条件下工作,而嗅觉检测器则是在常压下工作,因此,两个部件的保留时间可能存在差异(一般质谱仪较短)。GC-O测定以人鼻作为检测器,对检测潜在的香气化合物具有很高的灵敏度[22-23]。目前,GC-O-MS应用于食品工业的两大主流趋势:一是快速分析香气化合物,二是鉴定关键香气活性物质。常用的检测方法可以检测挥发物的浓度和类型,但大多数食品中只有有限数量的香气活性成分可以促进整体的香气表达,进而引入了感官评价[24]。

2.3 气相-离子迁移谱法

离子迁移谱法(ion mobility spectrometry,IMS)是20世纪60年代发展起来的一种技术,能够检测不同基质中挥发性和半挥发性微量有机化合物。在常压条件下,就能够根据离子在中性缓冲气体中的迁移率来表现出快速响应和高灵敏度。IMS系统的结构包括电离源和漂移管,其中,漂移管是IMS系统的核心部分,由电离区和分离区组成[25]。样品首先被加热和汽化,通过载气转移到电离区。接着,样品分子和载气分子被离子源电离,在分离区形成具有不同漂移时间的各种产物离子。随之在电场的作用下离子发生移动,因漂移物具有不同的迁移率,它们在不同的时间被检测到,这将提供分析物类型和含量的有关信息[26]。GC-IMS兼备GC的高分离能力和IMS的快速响应能力,是一种新兴的气相分离和检测技术,已广泛应用于各个领域,其中,在食品新鲜度、产地溯源、掺伪检测、加工制作过程中品质评价等方面取得很好的实践效果[27-32]。

3 挥发性风味分析技术在传统发酵豆制品中应用

3.1 酱油

酱油在中国已有3 000多年的历史,作为一种传统的发酵调味品,其味道会直接影响酱油的质量和消费者的偏好。酱油中已鉴定出近300种芳香化合物,如苯乙醛、2,3-二乙基吡嗪、2-苯乙醇、糠醇、丁二醇[33]。其中,发酵阶段的微生物菌群代谢活动是酱油特征风味物质形成的重要时期。作为有机氮来源,酵母提取物中的氨基酸可被细菌直接利用,是影响生物量形成的主要成分,同样,微生物对氨基酸的利用具有一定的选择性。Zhou等[34]采用HS-SPME-GC-MS技术研究添加不同氨基酸的酵母提取物对酱油香气品质的影响。结果发现,与对照组相比,酵母提取物加入组形成更明显的麦芽味、更高的花香和果香识别度。值得注意的是,4-乙基苯酚含量增加了43.26%,酯类含量增加了42.83%。猴头菇是一种具有许多健康益处的可食用蘑菇,可被用于酱油制作来改善其品质。Zhao等[35]比较了添加和不添加猴头菇在酱油酿造过程中挥发性风味物质变化的情况,结果发现,添加猴头菇的酱油样品中酯类和醇类物质的含量明显增加,而酮类、醛类、吡嗪类物质的含量有所降低,这为通过改变原料成分来调节酱油的品质提供了新的思路。小麦是酱油酿造过程中广泛使用的原料之一,但它缺乏某些生物活性物质。萌发处理是一种广泛应用于提高种子营养特性的方法。Shi等[36]比较发芽和未发芽处理小麦对酱油酿造风味特征的影响。结果发现,小麦萌发组酯类、醇类和酮类物质的含量增加,特别是添加小麦萌发24 h的原料,可以在提高酱油中生物活性物质含量的同时,进一步增强其风味。

3.2 腐乳

腐乳也称作发酵豆腐、发霉豆腐、东方奶酪等,是一种典型的传统固态发酵豆制品,其不仅有着浓郁的风味和柔软的奶酪状等感官属性,也含有一些促进健康和降低抗营养因子的生物活性成分[37-38]。腐乳的制作主要包括豆腐生产、初步发酵、酸洗和后发酵[39-40],这个过程通常需要至少2～3个月才能达到理想的味道。根据使用发酵剂种类的不同,腐乳可分为霉菌发酵型(Mucorwutongqiao,Actinomucorelegans或Mucorrouxianus)、细菌发酵型(Micrococcus或Bacillus)和酶促发酵型3类[41]。由于其独特的风味和丰富的营养,已成为餐桌上广受消费者欢迎的调味品。尽管它可以直接食用,但通常被用作调味料来改善其他食物的味道[42]。Chen等[43]研究添加不同发酵剂对腐乳制作过程中微生物菌群、理化性质和挥发性风味化合物的动态变化影响。结果表明,对照组(Rhizopusoligosporus)样品中醇类、醛类和酯类是主要的挥发性风味化合物,而MSC-B、MSC-A混菌发酵处理分别以醛类、醇类化合物为主。在预发酵阶段,不同的发酵剂会产生不同的优势风味化合物。比较不同发酵剂的挥发性风味特性,将为开发新的混合发酵剂提供重要的理论参考。Li等[44]研究茶陵红腐乳在后发酵不同时期微生物菌群和风味成分的变化。结果表明,在后发酵过程中形成了苯乙醛、芳樟醇、2-戊基呋喃等一系列挥发性化合物。并首次发现茶陵红腐乳中呈奶油乳香味的壬酸与红酵母菌属(Rhodotorula)呈强正相关。陈卓等[45]采用HS-SPME-GC-MS技术检测红腐乳后发酵过程中挥发性风味物质,共鉴定出50种化合物,其中,以酯类和醇类物质为主。结合气味活度值,确定15种挥发性风味成分对红腐乳香气的贡献程度高。Wang等[46]研究了王致和红腐乳样品在发酵过程中挥发性风味图谱的动态变化,并比较4种典型商业红腐乳的挥发性化合物组成,进一步确定了商业红腐乳的关键呈香物质。结果表明,酚类和醇类在模塑阶段和盐渍阶段占优势,而酯类和醇类在后发酵阶段积累更多。这些发现将为传统发酵豆制品风味形成机理的深入解析提供新的见解。后续,还需要进一步研究来揭示基于产品数量和微生物生长参数的核心微生物与风味成分之间的实时相关性。

3.3 豆豉

豆豉是东亚和东南亚的传统发酵食品之一,通常可分为曲霉型(Aspergillus-type)、细菌型(Bacterial-type)、毛霉型(Mucor-type)、根霉型(Rhizopus-type)四大类。豆豉的主要原料是大豆或黑豆,它的营养物质丰富,富含脂肪酸、酯类和氨基酸,如亚油酸乙酯[47]。微生物在发酵过程中产生的蛋白酶和淀粉酶可以有效分解大豆中蛋白质和淀粉,产生新的营养物质和调味剂。豆豉不仅是一道菜肴,而且可用于烹饪过程,在人们的日常生活中起着重要的作用。值得注意的是,毛霉型豆豉含有更多的酸类、醇类、醛类和酯类物质,而曲霉型豆豉含有更多的吡嗪类和酚类物质[48]。永川豆豉具有独特的风味,是毛霉型豆豉的代表,其香气强烈而持久,呈深褐色,质地柔和,深受广大消费者的青睐[49]。Wang等[50]采用GC-O和GC-MS技术对永川豆豉的关键香气化合物进行了表征,共鉴定出49种芳香化合物,进一步通过香气提取稀释分析和定量分析手段筛选出20种高风味稀释因子和气味活性值大于1的芳香化合物。其中,2,3-丁二酮(黄油、奶酪味)、二甲基三硫化物(类似大蒜味)、乙酸(辛辣味)、乙酰吡嗪(类似爆米花味)、3-甲基戊酸(汗味)、4-甲基戊酸(汗味)、2-甲基苯酚(烟熏味)、麦芽糖(焦糖味)、γ-壬内酯(椰子味)、丁香酚(木质味)和苯乙酸(花木味)对风味整体的贡献程度更高。索化夷等[51]采用HS-SPME-GC-MS技术对不同发酵阶段永川豆豉香气成分进行研究,发现酯类和烯类化合物数量增加明显,以乙酸乙酯、苯甲酸乙酯、3-辛酮、苯乙醇、苯甲醛等挥发性物质为主。浏阳豆豉是典型的曲霉型豆豉,起源于中国的汉代,历史悠久。其工艺主要包括真菌固态发酵,然后是清洗和成熟。Chen等[52]采用HS-GC-IMS和HS-SPME-GC-MS技术,研究了浏阳豆豉发酵过程中挥发性有机化合物的变化,共鉴定出115种挥发性风味物质,大部分是在渥堆过程中积累的。有趣的是,大多数醇类和酸类物质随着发酵时间的延长而减少,而酯类、酮类、吡嗪类和酚类在渥堆过程中增加。基于化学计量学分析,初步确定己醇、己醛、丙酸作为发酵前的特征标记物产生豆腥味和青草味;1-辛烯-3-醇和3-辛酮作为豆豉发酵3～9 d的特征标记物呈蘑菇味;而酯类和吡嗪类,特别是乙酸乙酯和2,6-二甲基吡嗪赋予成熟豆豉浓郁的水果味、坚果味和可可香。文鹤等[53]通过HS-SPME-GC-MS技术探究快速工艺制作下曲霉型豆豉不同发酵阶段挥发性风味物质的演替规律。结果发现,后发酵阶段的挥发性香气成分含量和种类明显增加,这与微生物菌群的代谢活动密切相关,这将为缩短传统发酵时间和调控豆豉品质提供新的思路。

3.4 大酱

大酱(Dajiang)呈玫瑰色,黏度适中,新鲜醇厚,在我国东北地区作为一种传统的天然发酵豆酱广受欢迎。大酱主要由大豆、面粉、食盐和水在适宜的温度和湿度条件下通过混合自发发酵而生成,同时保证发酵过程在不导致其变质的情况下进行[54]。通常,它被用作调味品,具有抗氧化、降胆固醇、抗癌和降血压作用[55]。大酱的传统发酵过程可分为制曲和制酱2个阶段,获得的大酱中含有大量的细菌和真菌。这种复杂的微生物菌群通过多种生化反应,导致初级代谢产物(有机酸和氨基酸)和次级代谢产物(生育酚、异黄酮和皂苷)的产生,而发酵过程的厌氧和高温条件有利于细菌的快速繁殖,微生物菌群的动态变化对大酱的品质产生一定的影响,并赋予了大酱独特的风味。但由于原料类型、发酵条件和加工工艺等不同,产品的风味差异很大[56-57]。An等[58]采用高通量测序、HS-SPME-GC-MS和氨基酸组分分析,解析了中国东北大酱的微生物菌群和代谢物谱的时间依赖性变化关系,确定了10种对大酱风味贡献程度高的挥发性化合物。进一步发现乳酸菌属(Lactobacillus)和四联球菌属(Tetragenococcus)是影响色度和挥发性风味的核心属。Ling等[59]研究不同贮藏年份大酱的微生物多样性和挥发性有机化合物之间的差异,结果发现,厚壁菌门和放线菌门在门水平上占主导地位,共鉴定出51种挥发性化合物,大部分香气物质存在于早期贮藏阶段。大多数酯类和醇类随着贮藏时间的延长而减少,而酸类和吡嗪类在贮藏后期明显积累,这有助于更好地揭示大酱中微生物菌群和挥发性有机化合物的形成机理。大酱的规模化工业生产依赖于单一的纯种发酵菌株,与传统工艺相比,缩短了生产周期,提高了产品的稳定性,但明显降低了味道、风味和适口性[60]。Zhang等[61]为了阐明商业大酱(CSP)和传统大酱(TSP)的风味差异,对收集的49份样品(13个CSP,36个TSP)进行了评价。采用电子鼻、气相色谱-质谱结合香气提取稀释分析对CSP和TSP样品的香气活性化合物进行挖掘,在搜集的CSP、TSP样品中分别有23,19种风味物质被确定为关键香气化合物。其中,酸类和酯类对传统大酱的整体香气贡献程度更大,而醇类、醛类、萜烯类和含硫化合物在商业大酱的风味中起着至关重要的作用,这将有助于全面了解传统和商业大酱中的关键香气化合物,并为改善工业产品的风味提供一定的帮助。

4 结论与展望

近年来,发酵豆制品因其更好的营养品质、广泛的生物活性(抗氧化、降血压、抗肿瘤等)、独特的风味和质地而成为科学研究者和消费者关注的热点。食品风味科学中提取、分离、检测和鉴定等先进技术可以确定数百种复杂的挥发性有机化合物和香气活性物质,使我们对各种传统发酵豆制品的香气组成有了深入和全面的了解。然而,每种传统发酵豆制品都有其独特的香气和味道,并受到发酵过程中不同的工艺步骤、原料、发酵剂类型和发酵技术等因素的影响。

为了进一步提升发酵豆制品的品质,未来可以围绕以下3个方面展开深层次的研究:首先,努力开发多元化发酵豆制品,综合利用大豆和豆类加工副产物的营养物质和功能成分。其次,深入研究发酵过程中功能生物活性成分的变化也将成为未来的新趋势。最后,为了生产高质量、安全的传统特色发酵豆制品,还有待改进发酵工艺和参数,寻找适合工业化发酵的优良菌株,并明确其发酵机制。