超高效液相色谱-串联质谱法测定调味品中去甲乌药碱和曲托喹酚

王建凤,冯月超,周欣燃,张怡,楚弘宇,王颖,杨志超,刘艳*

(1.北京市科学技术研究院分析测试研究所(北京市理化分析测试中心),北京市食品安全分析测试工程技术研究中心,北京 100089;2.北京农学院 食品科学与工程学院,北京 100096;3.北京建筑大学建筑结构与环境修复功能材料北京市重点实验室,北京 100044)

去甲乌药碱属于苄基异喹啉类生物碱,是一种天然的生物碱,能够刺激β受体,常被用作强心剂、利尿剂等,可抑制生物体EGFR/JAK2/c-JUN、TGF-β1/Smad等信号通路[1-3],用于治疗心脏病[4],广泛存在于花椒、胡椒、桂皮、八角等天然植物中,这些植物常被用作调味品,因此可能导致误食而出现兴奋剂阳性事件[5-7]。曲托喹酚具有罂粟碱样解痉作用,与沙丁胺醇的作用相似。上述两种物质均因具有扩张血管、改善血液循环的作用从而使身体进入早期兴奋状态的特点[8],世界反兴奋剂机构明确将二者列入禁用清单。为完善食品安全风险监测手段[9-10],开展去甲乌药碱和曲托喹酚等食源性兴奋剂检测技术研究十分必要。

液相色谱法[11]、液相色谱-串联质谱法[12]和衍生化气相色谱法[13]等分析方法已被应用于香辛料[14-15]、药材[16-18]及运动员尿液[19-21]、血清[22]、膳食补充剂[23]中去甲乌药碱的检测。目前针对去甲乌药碱和曲托喹酚同时分析的方法很少,仅有Yan等[24]报道了植物源的调味品中运用固相萃取法针对这两种兴奋剂同时测定的检测方法,但是方法中未提到复合调味料的测定,同时对于含量较高且容易超出线性范围的样品的分析未明确样品制备过程中具体步骤、样品是否进行稀释等问题。

通常在调味品中测定的参数集中于重金属[25]、真菌毒素[26-27]、毒品[28]以及主效成分[29]等,对于去甲乌药碱和曲托喹酚在复合调味料中的分析方法未见报道,针对这两种目标物同时分析的方法缺乏、方法灵敏度有待进一步提升等需求,本研究利用UHPLC-MS/MS开发单一及复合调味品中去甲乌药碱和曲托喹酚同时测定的定量分析方法,为避免因误食而导致兴奋剂阳性事件提供了技术和基础数据支撑。

1 材料和方法

1.1 材料

花椒7种、胡椒9种、辣椒4种、八角1种、油辣椒1种、辣酱8种、火锅底料6种、烧烤料2种、腌制料4种和咖喱粉2种:购于超市和集贸市场。

1.2 试剂

甲醇、乙醇、乙腈(均为色谱纯):美国Thermo Fisher Scientific公司;甲酸(色谱纯):阿法埃莎(中国)化学有限公司;石墨化碳黑(graphitized carbon black,GCB,120～400 μm)、十八烷基键合硅胶(octadecylsilane chemically bonded silica,C18,40～60 μm)、N-丙基乙二胺(primary secondary amine,PSA,40～60 μm)、氨基吸附材料(NH2,40～60 μm):天津博纳艾杰尔科技有限公司;中性氧化铝(Al2O3,100～200目):国药集团化学试剂有限公司;EMR(1 g,6 mL):美国Waters公司;甲酸铵、乙酸铵(均为色谱纯):北京百灵威科技有限公司;去甲乌药碱(纯度99.2%,CAS:5843-65-2):上海安谱实验科技股份有限公司;曲托喹酚盐酸盐(纯度99.07%,CAS:18559-59-6):加拿大Toronto Research Chemicals公司;去甲乌药碱-D4(纯度99.1%,100 μg/mL,CAS:2249814-83-1)、曲托喹酚盐酸盐-D9(纯度99.6%,100 μg/mL,CAS:18559-63-2):天津阿尔塔科技有限公司;实验室用水:Milli-Q超纯水制备系统制备。

1.3 主要仪器与设备

Xevo TQ-S超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪、色谱柱Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)、色谱柱Acquity UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)、色谱柱Acquity UPLC BEH HILIC(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)、色谱柱Acquity UPLC BEH Amide(100 mm×3.0 mm,1.7 μm) 美国Waters公司;GR22GⅢ高速冷冻离心机 日本HITACHI公司;N-EVAPTM 112恒温水浴氮吹仪 美国Organomation公司;MS200多管涡旋混匀仪 杭州瑞诚仪器有限公司;Vortex-genie 2涡旋混合器 美国Scientific Industries公司;KQ-500DE数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 标准溶液的配制

分别称取去甲乌药碱和曲托喹酚盐酸盐标准品10 mg(精确至0.000 01 g),加入甲醇,超声溶解,定容于10 mL容量瓶中,混匀,得到1 000 mg/L标准储备液,于-20 ℃保存,分别准确移取两种标准储备液适量,用甲醇配制成10 mg/L的混合标准品外标储备液;准确移取去甲乌药碱-D4和曲托喹酚盐酸盐-D9标准品各1 mL,加入甲醇,超声溶解,定容于10 mL容量瓶中,混匀,得到10 mg/L混合标准品内标储备液;准确移取10 mg/L混合标准品内标储备液1 mL,加入甲醇,超声溶解,定容于10 mL容量瓶中混匀,得到1 mg/L混合内标工作液。

1.4.2 样品前处理及测定方法

1.4.2.1 辣椒、辣酱、火锅底料(含油)、八角

称取试样2 g(精确到0.01 g)于50 mL具塞螺旋盖聚丙烯离心管中,准确加入100 μL 1 mg/L混合内标工作液,加入20 mL含5%甲酸的乙醇溶液,涡旋混匀,振荡提取30 min,8 000 r/min离心5 min。移取2.0 mL上清液于10 mL净化管中,加入65 mg GCB、65 mg C18和65 mg EMR,涡旋混合,8 000 r/min离心5 min,移取1.0 mL上清液,氮气吹至近干,1.0 mL初始流动相复溶,涡旋30 s,用0.22 μm尼龙微孔滤膜过滤,滤液采用基质标准曲线定量。

1.4.2.2 花椒和胡椒

花椒和胡椒中曲托喹酚的分析按照1.4.2.1前处理方法,采用溶剂标准曲线定量。而对于去甲乌药碱的测定,其前处理步骤与1.4.2.1前处理方法略有不同,样品经提取离心后,需准确移取0.50 mL上清液至25 mL容量瓶中,加入125 μL 1 mg/L混合内标工作液,用含5%甲酸的乙醇溶液稀释定容,摇匀,再从容量瓶中移取2.0 mL溶液进行净化,重复1.4.2.1中后续步骤,滤液采用溶剂标准曲线定量。

1.4.3 基质空白提取液的制备

取不含被测物的样品,按照1.4.2操作处理,得到基质空白提取液,用于配制系列标准工作溶液。

1.4.4 仪器条件

1.4.4.1 质谱条件

电喷雾离子源(electrospray ionization,ESI)正离子模式电离,采用多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)模式;毛细管电压3.00 kV;离子源温度150 ℃;锥孔反吹气流量50 L/h;脱溶剂气流量800 L/h;脱溶剂气温度500 ℃;碰撞气氩气;MRM参数见表1。

表1 去甲乌药碱和曲托喹酚的MRM参数Table 1 MRM parameters of higenamine and tretoquinol

1.4.4.2 色谱条件

ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm);流动相A:甲醇,流动相B:10 mmol/L甲酸铵水溶液(含0.1%甲酸),流速:0.3 mL/min;进样量:5 μL;柱温:30 ℃,梯度洗脱程序:0～1.5 min,3% A;1.5～5.5 min,3%～95% A;5.5～5.6 min,95%～3% A;5.6～7.5 min,3% A。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

分别配制质量浓度为100 ng/mL的标准溶液,直接进行质谱分析,一级质谱扫描,去甲乌药碱和曲托喹酚均在ESI+模式下获得丰度较高的[M+H]+分子离子峰,优化锥孔电压,获得最佳检测条件,以准分子离子峰为母离子进行二级质谱扫描,优化碰撞电压,选择相对丰度较高的两个碎片离子作为定量和定性离子,所得的离子对与文献报道一致[21,30],质谱条件见表1。

2.2 色谱条件的选择

2.2.1 色谱柱的选择

由于兴奋剂种类较多,选择一种通用的色谱柱对于将来建立高通量兴奋剂检测技术尤为重要,本研究考察了C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)、HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)、HILIC (100 mm×2.1 mm,1.7 μm)和Amide(100 mm×3.0 mm,1.7 μm)4种不同极性的超高效液相色谱柱对两种物质的保留行为。

采用C18色谱柱分离时,去甲乌药碱和曲托喹酚峰形对称性和分离效果好;采用极性较强的HILIC色谱柱分离时,两种物质分离度差,峰形严重拖尾;采用Amide色谱柱分离时,曲托喹酚和去甲乌药碱的色谱峰出现峰展宽现象,且当运用于实际样品的测定时,物质的色谱峰保留时间会出现前移,怀疑可能是由于样品中存在部分净化不完全的极性小分子,在通过色谱柱时与本身具有极性的Amide填料发生相互作用,短时间范围内遮挡了填料表面的活性位点,从而减小了待测物与填料的接触面积,降低了色谱保留行为,进而导致出峰时间提前;而考察HSS T3柱时,两种物质的色谱峰峰形对称性好、分离度好,与C18色谱柱比较,该色谱柱对于曲托喹酚和去甲乌药碱的响应较强,同时对于强极性的化合物也有一定的保留效果,因此,为了与高通量兴奋剂的分析方法兼容,本研究选择了HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)作为最佳色谱柱。

2.2.2 流动相的选择

流动相的优化对于被测物的峰形以及响应强度有着重要的影响。本研究对流动相进行优化,结果见图1。

当甲醇和乙腈分别作为流动相的有机相时,曲托喹酚和去甲乌药碱的峰形对称性较好,但在甲醇中两种物质的响应明显增强;缓冲盐体系作为流动相时,可以改善物质的峰形,而加入酸则可以增强化合物的电离,通过比较甲醇-水溶液体系、甲醇-水(含0.1%甲酸)体系和甲醇-10 mmol/L甲酸铵水溶液(含0.1%甲酸)体系,结果发现,甲醇-10 mmol/L甲酸铵水溶液(含0.1%甲酸)体系下两种物质的响应最强,峰形最好,在此基础上优化洗脱条件,得到两种物质的最佳色谱图,见图2。

2.2.3 提取溶剂的选择

待测物的结构式中均含有酚羟基, 酸性条件可以抑制酚羟基的电离, 使化合物呈现分子状态,更容易被有机物提取出来。分别采用0.5%甲酸-甲醇(FM)、0.5%甲酸-乙醇(FE)、0.5%乙酸-甲醇(HM)、0.5%乙酸-乙腈(HA)、0.5%乙酸-乙醇(HE)5种不同提取溶剂对辣椒中去甲乌药碱和曲托喹酚进行提取,结果见图3。5种提取液均能将待测物质提取出来,FE提取溶剂中,曲托喹酚和去甲乌药碱的提取效率最高,故在后续实验中选择FE为提取溶液。

图3 提取溶剂对曲托喹酚和去甲乌药碱回收率的影响(n=3)Fig.3 Effects of extraction solvents on the recovery rates of higenamine and tretoquinol (n=3)

2.2.4 净化剂的选择

由于调味品基质较复杂,若样品不经净化,提取后的上清液颜色太重,色谱图基线本底高,方法灵敏度差;相比液液萃取法、固相萃取法,采用分散固相萃取具有分析速度快、绿色环保、分析成本低等优点[24,26]。因此,首先通过单一净化剂考察法对净化剂进行优化,结果见图4。

图4 吸附剂种类对曲托喹酚和去甲乌药碱回收率的影响(n=3)Fig.4 Effects of sorbent types on the recovery rates of higenamine and tretoquinol (n=3)

由图4可知,当加入填料200 mg PSA、200 mg NH2和200 mg中性Al2O3分别净化时,曲托喹酚和去甲乌药碱均有不同程度的吸附,导致回收率偏低; 而填料200 mg C18、200 mg GCB和200 mg EMR分别进行净化时,对于两种化合物的吸附较小。因此,进一步采用以下4种组合方案:GCB 100 mg+C18100 mg; GCB 100 mg+EMR 100 mg;C18100 mg+EMR 100 mg; GCB 65 mg+C1865 mg+EMR 65 mg,结果见图5。 4种不同组合方案对曲托喹酚和去甲乌药碱的回收率影响较小,回收率较稳定,且均满足分析的要求。基于C18可以去除样品中的非极性分子[31],GCB可以去除样品中的色素[32],EMR可以去除样品中的脂类[33],三者配合使用可减少基质干扰,延长色谱柱的使用寿命。

图5 不同净化剂组合对曲托喹酚和去甲乌药碱回收率的影响(n=3)Fig.5 Effects of different purificant combinations on the recovery rates of higenamine and tretoquinol (n=3)

2.3 方法学考察

2.3.1 检出限和定量限

依据标准GB/T 27417-2017《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》中关于检出限的规定,本实验通过在样品中添加低浓度目标物,按照1.4.2进行样品前处理,经仪器测定后,结合仪器测定结果以及被测化合物的信噪比确定方法的检出限和定量限,见表2。

表2 不同调味品中曲托喹酚和去甲乌药碱的线性方程、检出限、定量限和基质效应Table 2 Linear equations, limits of detection, limits of quantification and matrix effects of higenamine and tretoquinol in different condiments

结果表明,曲托喹酚的检出限和定量限在6类基质中一致,分别为0.03,0.1 μg/kg。而去甲乌药碱的检出限和定量限在不同基质中有所不同,在辣椒、辣酱、火锅底料、八角基质中,去甲乌药碱的检出限和定量限分别为0.1,0.5 μg/kg;在花椒和胡椒基质中,去甲乌药碱的检出限和定量限分别为5.0,25 μg/kg。

SN/T 5171-2019《出口植物源性食品中去甲乌药碱的测定 液相色谱-质谱/质谱法》中规定了白菜、火龙果、橙子、花生、辣椒、川芎中出口植物源食品中去甲乌药碱残留量的测定,其检出限为10.0 μg/kg,定量限为30.0 μg/kg,与国标方法比较,本方法更灵敏;与Yan 等[24]所建立的方法比较,除花椒和胡椒外,本方法的定量限更低。

2.3.2 标准曲线和基质效应

移取适量标准溶液,分别采用初始流动相和空白样品提取液配制成系列标准工作液,以质量浓度作为横坐标,外标和内标的定量离子与峰面积之比作为纵坐标,绘制标准曲线,以斜率之比考察6类调味品中的基质效应,在辣椒、辣酱、火锅底料、八角中,曲托喹酚的基质效应介于86.8%～96.6%之间,基质效应不明显,去甲乌药碱的基质效应介于125.2%～241.9%之间,表现出明显的基质效应,由于两种物质同时进行分析,因此在后续实际样品的测定中,采用基质标准曲线进行定量分析,结果显示,去甲乌药碱和曲托喹酚在质量浓度0.05～5.0 ng/mL范围内线性系数均大于0.995,线性关系良好。

然而在胡椒和花椒基质中,曲托喹酚的基质效应分别为101.8%和97.8%,基质效应不明显,可采用溶剂标准曲线定量分析;对于去甲乌药碱,由于花椒和胡椒中含有内源性去甲乌药碱,所以空白基质不容易找到,导致用空白提取液配制标准溶液计算基质效应不准确。针对花椒和胡椒样品中去甲乌药碱的分析,前处理过程中,样品提取液被稀释50倍,稀释倍数较大,通过分析花椒、胡椒样品以及对应的加标样品中去甲乌药碱的含量,证明此时基质中本身存在的物质对于去甲乌药碱的测定基本不存在影响,因此后续采用溶剂标准曲线定量分析。

2.3.3 回收率和精密度

取空白辣椒、八角、火锅底料(含油)、辣酱4类样品,每类样品中分别加入3个不同浓度水平1.0,2.0,10.0 μg/kg的标准物质;按照上述前处理步骤处理,回收率见表3。

表3 调味品中去甲乌药碱和曲托喹酚的回收率(n=6)Table 3 Recovery rates of higenamine and tretoquinol in condiments (n=6)

结果表明,4类基质中曲托喹酚的平均回收率介于83.7%～111.9%之间,精密度小于7%;去甲乌药碱的平均回收率介于94.4%～113.1%之间,精密度小于11%。

取花椒、胡椒两类样品,若仍然按上述4类基质中的添加水平添加,则本底值太高,添加效果不明显,所以选择去甲乌药碱的3个添加水平分别为50,100,500 μg/kg,曲托喹酚的添加水平仍为1.0,2.0,10 μg/kg,按照上述前处理步骤处理,曲托喹酚的平均回收率介于84.5%～100.9%之间,精密度小于5%;去甲乌药碱的平均回收率介于88.8%～118.0%之间,精密度小于16%。

综上所述,6种基质中所测回收率结果满足GB/T 27417-2017附录A中规定的浓度水平范围(<0.1 mg/kg),回收率在60%～120%范围内,浓度在0.1～1 mg/kg范围内,回收率在80%～110%范围内;精密度结果基本满足GB/T 27417-2017附录B中规定的被测组分含量为1～1 000 μg/kg(1 mg/kg)时的要求。

2.4 实际样品的测定

从市场上随机购买了44种调味品,依照本方法进行实验,实验结果表明所有样品中均未检出曲托喹酚,70.4%样品中检出去甲乌药碱,结果见表4,含量介于0.56～1 962 μg/kg之间。所测的花椒和胡椒样品中均有去甲乌药碱检出,含量相对较高,其中花椒样品中去甲乌药碱含量介于206～1 962 μg/kg之间;胡椒样品中去甲乌药碱含量介于24.9～488 μg/kg之间;只测了1个八角样品,去甲乌药碱未检出;所测1个油辣椒中去甲乌药碱含量为2.51 μg/kg;8个辣酱样品中,5个未检出,3个有检出,含量较低,介于0.56～1.57 μg/kg之间;6个火锅底料中,1个未检出,其余5个含量介于0.57～7.82 μg/kg之间;2个烧烤料和咖喱粉中均有检出,含量介于0.80～2.36 μg/kg之间;4个腌制料中,2个有检出,含量分别为2.32 μg/kg和3.23 μg/kg。

表4 实际调味品中去甲乌药碱的含量Table 4 The content of higenamine in actual condiments

3 结论

本研究同时分析去甲乌药碱和曲托喹酚,并将调味品种类从植物源调味品拓展至复合调味品,针对样品基质和目标物固有的特性,对方法进行系统的优化及开发,建立了不同种类调味品中去甲乌药碱和曲托喹酚的分析方法。样品经0.5%甲酸的乙醇提取,C18、GCB和EMR 3种填料混合净化,UPLC-MS/MS分析,内标法定量。将该方法应用于常见市售的44种调味品中,所有样品中均未检出曲托喹酚,部分检出去甲乌药碱,结合配料信息,其中花椒和胡椒样品的去甲乌药碱含量最高,对于配料表中明确含有花椒、胡椒等成分的调味料样品,去甲乌药碱含量其次。所开发的方法具有灵敏度高、分析速度快、稳定性好和通用性强的特点,适合于调味品中去甲乌药碱和曲托喹酚的分析。鉴于去甲乌药碱作为部分植物源调味品中的内源性物质,为了避免大型赛事中运动员因误服造成兴奋剂阳性事件,在本研究基础上,有必要开展对采用含去甲乌药碱的调味品加工后的食品的监控以及不同食品加工工艺对去甲乌药碱残留量的研究工作;而对于曲托喹酚,目前还没有明确的调味品或食品中的相关标准,可进一步将其标准化。