Bacillus amyloliquefaciens SY07发酵绿豆的体外降血糖活性及风味成分分析

赵雪如,李佳莹,付玮琦,任佳敏,李风娟

(天津科技大学 食品科学与工程学院,省部共建食品营养与安全国家重点实验室, 食品营养与安全教育部重点实验室,天津 300457)

解淀粉芽孢杆菌属于芽孢杆菌属,为革兰氏阳性菌,是一种公认的GRAS安全菌[1]。已有研究指出解淀粉芽孢杆菌具有产蛋白酶和淀粉酶的能力,故现也被用于生产发酵豆制品[2]。Yang等[3]在解淀粉芽孢杆菌SWJS22发酵豆粕的实验中发现,经过发酵豆粕中的酚类物质、黄酮类物质和低分子肽含量均显著上升,且表现出了较好的抗氧化活性。Wu等[4]用解淀粉芽孢杆菌发酵米豆,发酵后米豆的理化性质得到明显改善,且抗氧化活性、DPP-IV和α-葡萄糖苷酶的抑制活性远高于未发酵米豆。绿豆(Vignaradiata(Linn.) Wilczek)是生活中常见的药食两用的豆类,富含蛋白质、不溶性膳食纤维、必需氨基酸和不饱和脂肪酸,还含有多种有益的活性成分,如单宁、酚类化合物、植物甾醇等[5]。已经有研究指出绿豆具有解毒、预防糖尿病、降血压和缓解中暑等功效[6]。绿豆作为一种原料已被应用于发酵新型豆制品[7-10]。

本研究利用解淀粉芽孢杆菌SY07(BacillusamyloliquefaciensSY07)作为发酵菌种,考察绿豆在发酵过程中体外降血糖活性、营养成分及挥发性风味成分的变化,为研发具有功能活性和良好风味的发酵豆制品提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

绿豆:购自赣州康瑞农产品有限公司。菌种:由本研究室从发酵豆渣中分离得到,并经中科院微生物研究所鉴定为解淀粉芽孢杆菌SY07(BacillusamyloliquefaciensSY07)。

1.1.2 试剂

α-葡萄糖苷酶(来源于大鼠)、α-淀粉酶(来源于猪胰腺)、4-硝基苯-α-D-吡喃葡糖苷(4-NPG)、谷胱甘肽、没食子酸、儿茶素:美国Sigma-Aldrich公司;Folin-Ciocalteu试剂:北京索莱宝公司。

1.2 仪器与设备

恒温培养箱 美墨尔特(上海)贸易有限公司;酶标仪 瑞士Tecan公司;真空冷冻干燥机 德国Christ公司;固相微萃取头 上海安谱科学仪器有限公司;气相色谱-质谱联用仪 日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 种子液培养

挑取固体培养基上的B.amyloliquefaciensSY07接种到液体种子培养基中(1%胰蛋白胨,0.5%酵母提取物,1% NaCl,pH为7),于37 ℃下培养12 h。

1.3.2 发酵

将绿豆用3倍体积的自来水浸泡12～14 h,随后于121 ℃、101 kPa的条件下蒸45 min。接种3%的种子液,将菌液和豆子均匀混合后在37 ℃的培养箱中培养0,8,16,24,32,40,48 h,将样品分别标记为L0、L8、L16、L24、L32、L40和L48。将最终得到的样品置于-20 ℃保存。

1.3.3 样品处理

对发酵后的样品进行冷冻干燥,研磨粉碎后与蒸馏水按1∶10(质量和体积比)充分混匀,超声提取10 min,在25 ℃,200 r/min的摇床上浸提30 min,10 000 r/min 离心10 min,用0.45 μm滤膜进行过滤收集上清液,将其浓度标记为100 mg/mL。

1.4 活性测定

1.4.1α-葡萄糖苷酶抑制活性

测定方法参考Xiao等[11]的方法。样品水提液与4-NPG溶液混合均匀后于37 ℃下反应50 min,最后加入Na2CO3终止反应,在405 nm下测定反应液的吸光值。

α-葡萄糖苷酶抑制率(%)=[1-(A1-A2)/(A3-A4)]×100%。

式中:A1、A2、A3和A4分别代表样品组、样品对照组、对照组和空白组的吸光值。

1.4.2α-淀粉酶抑制活性

测定方法参考Zhou等[12]的方法。样品水提液与α-淀粉酶于37 ℃下水浴5 min,再加入可溶性淀粉溶液于37 ℃水浴30 min,最后加入DNS试剂终止反应。将反应液沸水浴10 min后于540 nm下测定吸光值。

α-淀粉酶抑制率(%)=[1-(A1-A2)/(A3-A4)]×100%。

式中:A1、A2、A3和A4分别代表样品组、样品对照组、对照组和空白组的吸光值。

1.5 成分测定

1.5.1 总酚含量的测定

采用福林(Folin)-酚试剂法[13]测定绿豆发酵过程中的总酚含量。以没食子酸为标准品绘制标准曲线,测定结果表示为没食子酸当量(mg GAE/g DW)。

1.5.2 总黄酮含量的测定

参考Jia等[14]的方法测定绿豆发酵过程中的总黄酮含量。以儿茶素为标准品绘制标准曲线,测定结果表示为儿茶素当量(mg CE/g DW)。

1.5.3 多肽含量的测定

绿豆发酵过程中多肽含量的测定采用邻苯二甲醛法[15]。以谷胱甘肽为标准品制作标准曲线,最终测定结果换算为g/100 g。

1.6 挥发性风味物质测定

采用HS-SPME-GC-MS技术[16]对B.amyloliquefaciensSY07发酵过程中绿豆的挥发性成分进行分析。

2 结果与分析

2.1 绿豆发酵过程中α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性的变化

由图1可知,发酵绿豆的α-葡萄糖苷酶抑制率在4.2%～50.3%之间变化。在发酵前24 h,α-葡萄糖苷酶抑制率快速升高,在24 h达到最大(50.3%),此时活性与未发酵绿豆相比提高了10.9倍。随后抑制活性开始缓慢下降,但依然维持着较好的抑制活性。α-葡萄糖苷酶是生物体糖代谢途径中的重要成员之一,通过抑制α-葡萄糖苷酶活性能够达到降低机体血糖水平的作用。Lee等[17]使用松茸菌丝体发酵大豆,4 d内α-葡萄糖苷酶的抑制率从16.2%增加到40.8%。先前已有研究证实相较于纳豆菌、米曲霉、黑曲霉和红曲霉,B.amyloliquefaciensSY07发酵大豆具有更突出的α-葡萄糖苷酶抑制活性[18]。

图1 绿豆发酵过程中的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性 Fig.1 Inhibitory activities of α-glucosidase and α-amylase during the fermentation of mung beans

发酵绿豆的α-淀粉酶抑制率在0%～92.0%之间变化。在未发酵的绿豆中未检测到α-淀粉酶抑制活性。发酵前24 h内,绿豆的α-淀粉酶抑制率显著上升,在24 h时抑制率达到最高(92.0%),随后抑制率开始下降,在发酵后24 h内同一显著性水平上依然保持着稳定的抑制活性。

2.2 绿豆发酵过程中营养成分含量的变化

B.amyloliquefaciensSY07发酵后绿豆表现出良好的体外降血糖活性,这可能与微生物在代谢过程中释放的酚类物质和活性肽有关[19-20]。绿豆发酵过程中总酚、总黄酮及多肽含量的变化见图2。

图2 绿豆发酵过程中营养成分的变化Fig.2 Change of nutrients in mung beans during fermentation

由图2可知,发酵过程中绿豆的总酚含量在1.4～3.0 mg GAE/g DW之间变化,随着B.amyloliquefaciensSY07发酵的进行,多酚含量逐渐增加,在发酵进行的第0～16 h,绿豆中的总酚含量快速积累,说明在发酵初期,微生物的代谢活动比较活跃;在发酵的第24～40 h,绿豆的多酚含量在同一显著性水平上保持稳定,在发酵的第48 h时,绿豆中的多酚含量达到最大值(3.0 mg GAE/g DW)。发酵过程中绿豆的总黄酮含量在0.8～1.6 mg CE/g DW之间变化,发酵48 h时的绿豆具有最高的黄酮含量(1.6 mg CE/g DW)。酚类因其潜在的生物活性而被大家广泛关注,发酵可以作为一种提高多酚含量的途径。Juan等[21]用枯草芽孢杆菌发酵黑豆,发酵过程中枯草芽孢杆菌会分泌β-葡萄糖苷酶,催化黑豆释放酚类物质和黄酮类物质,导致这些化合物含量上升。绿豆种皮中含有丰富的酚酸类物质,主要以结合的形式存在,B.amyloliquefaciensSY07发酵有利于酚类物质释放,提高绿豆中的多酚含量[22]。

绿豆原料中的多肽含量为0.75 g/100 g,随着发酵的进行,绿豆中多肽的含量逐渐增加,在发酵的第48 h时达到最高(5.4 g/100 g),与未发酵的绿豆相比提高了6.2倍。在发酵的前32 h内,绿豆的多肽含量快速积累,说明此时微生物酶活性较高,对绿豆中的蛋白质利用度也比较高,在发酵的后8 h内多肽含量相对稳定。在微生物发酵过程中,微生物可以有效弱化豆类原料中蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂的作用,能够消耗原料中的蛋白质,将豆子中的蛋白质分解为肽和氨基酸,从而提高豆类蛋白的消化率[23]。

2.3 绿豆发酵过程中风味物质的变化

由图3可知,B.amyloliquefaciensSY07发酵绿豆过程中共检测到96种挥发性物质,包括28种醇类物质,22种酮类物质,8种醛类物质,8种酸类物质,10种酯类物质,3种酚类物质,4种烷烃类物质,3种醚类物质,2种呋喃类物质,2种吡嗪类物质和6种其他类物质。并进一步对挥发性物质的OAV进行计算,OAV>1的物质对食品的风味具有一定的贡献作用[24]。

由图4可知,共检测到11种挥发性物质。样品L0中OAV>1的物质有3种,分别是芳樟醇、异戊酸、愈创木酚;L8中OAV>1的物质有5种,分别是3-羟基-2-丁酮、PPG-2甲醚、芳樟醇、异戊酸、愈创木酚;L16中OAV>1的物质有4种,分别是二甲基二硫、3-羟基-2-丁酮、芳樟醇、愈创木酚;L24中OAV>1的物质有7种,分别是二甲基二硫、3-羟基-2-丁酮、二甲基三硫、1-辛烯-3-醇、芳樟醇、愈创木酚、苯乙酸甲酯;L32中OAV>1的物质有5种,分别是二甲基二硫、二甲基三硫、1-辛烯-3-醇、愈创木酚、芳樟醇;L40中OAV>1的物质有5种,分别是1-辛烯-3-醇、芳樟醇、2-甲基丁酸、愈创木酚、6-甲基-2-庚酮;L48中OAV>1的物质有3种,分别是1-辛烯-3-醇、芳樟醇、愈创木酚。

图4 发酵过程中绿豆的OAV>1的风味物质热图分析 Fig.4 Heatmap analysis of flavor substances with OAV>1 in mung beans during fermentation

可以发现芳樟醇和愈创木酚存在于绿豆发酵的全过程,是B.amyloliquefaciensSY07发酵绿豆的特征风味物质,赋予发酵绿豆独特的花草香[25]和烟熏味;1-辛烯-3-醇被认为是给蒸煮豆子带来豆腥味的物质,是在豆子浸泡过程中产生的,然而在本实验中,未发酵的绿豆中并未检测到1-辛烯-3-醇,在发酵的24～48 h有检测到,在发酵40 h的绿豆中有较高的OAV,随后减小,给发酵绿豆带来蘑菇香气[26];3-羟基-2-丁酮,又称乙偶姻,能够赋予发酵绿豆奶油香,未发酵的绿豆中没有检测到该物质,该物质出现在8～32 h的样品中,该物质在发酵8 h的绿豆中具有最高的OAV,之后随着发酵时间的延长而减小。异戊酸具有强烈刺激性气味,该物质只存在于发酵的第0～8 h,是给L0和L8带来不良风味的关键物质之一。此外,在过程中还检测到2种硫化物,在发酵的中后期出现,具有不良气味,但其OAV较低,不会影响到整体的风味。

3 结论

与未发酵的绿豆相比,B.amyloliquefaciensSY07发酵绿豆的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性均显著提升,且发酵24 h的绿豆表现出了优良的潜在降血糖活性。此外,B.amyloliquefaciensSY07发酵明显提高了绿豆的多酚、黄酮和多肽含量。GC-MS数据分析结果显示,在发酵绿豆中共检测到11种OAV>1的物质,分别是芳樟醇、异戊酸、愈创木酚、3-羟基-2-丁酮、PPG-2甲醚、二甲基二硫、二甲基三硫、1-辛烯-3-醇、苯乙酸甲酯、2-甲基丁酸、6-甲基-2-庚酮。可进一步探究发酵绿豆中关键活性物质及特征性风味成分的代谢途径,为B.amyloliquefaciensSY07在功能性食品中的深入应用及开发兼具良好风味的功能性发酵豆制品提供理论指导。