二维液相色谱在食品检测方面的应用进展

邢倩倩

(1.乳业生物技术国家重点实验室,上海乳业生物工程技术研究中心,光明乳业股份有限公司乳业研究院,上海 200436;2.食品营养与安全协同创新中心,江苏 无锡 214122)

随着食品工业的发展,对现代分析技术提出了更高要求,需表征尽可能多的食品组成成分和使检测的微量食品组分达到更高的灵敏度,进而了解食品物质组成基础[1]。近些年伴随着分析化学的进展,易操作的先进仪器逐步出现,传统食品分析方法正在逐步被功能强大的分析技术所取代,如多维色谱技术和质谱技术在食品分析方面的广泛应用[2]。二维液相色谱在揭示食品复杂基质组成、提供高分离能力和未知调味化合物识别方面具有明显优势[3]。

1 二维液相色谱简介

1.1 原理

二维分离的理念由Giddings[4]提出,通过将两个独立的色谱分离过程组合到一起实现,在该分离过程中样品经过两次不同机理的分离过程,因此分离能力远高于传统一维分离。传统的一维色谱在分离复杂样品过程中会发生峰交叉、共流出和分离度不足等现象,说明一维色谱存在峰容量不足的问题。二维液相色谱对复杂样品的分辨率远高于传统一维液相色谱,该分辨能力即峰容量。峰容量是指色谱体系中用最小分离度分得的最多峰个数的理论值[5]。二维液相色谱的理论峰容量为两种分离模式峰容量的乘积。因此,建立二维液相色谱应尽量选择两种不同的分离模式,保证正交性最大,即充分利用两种分离模式的峰容量[6]。

在实际应用中,二维液相色谱可通过组分由第一维到第二维的转移方式分为离线、在线或流速停止模式[7]。在离线二维液相色谱模式中,首先手动接出一维分离后的各个组分,处理后直接进入第二维分离模式。在线二维液相色谱模式中,第一维和第二维通过接口或是调谐器连接,可自动收集一维组分直接进入第二维进行分析[8—10]。流速停止二维液相色谱模式中,第一维流速停止开始第二维分离过程,第二维完成后再重启第一维分离模式,完成后再依次开启第二维分离模式。

1.2 分类

二维液相色谱包括中心切割二维色谱和全二维液相色谱。中心切割模式可应用于对第一维色谱中某个特定组分进行第二维分离的过程,全二维模式应用于对于第一维色谱中所有组分进行第二维分离的过程。在全二维分离模式中,必须保证第一维的组分无损伤地全部进入第二维,即需要保证第一维的样品收集率比较高。

1.3 特点

二维液相色谱系统在分离能力方面远强于传统一维色谱,这也是其成功应用于食品分析的最大优点[11]。另外,二维液相色谱系统也可与质谱串联使用,提高分离效率和识别能力[12]。基于二维液相色谱具有诸多优点,近些年在食品方面应用愈加广泛。本文针对近些年二维液相色谱在食品分析方面的应用展开讨论。

2 二维液相色谱在食品溯源和安全方面的应用

食品中的风险物质和危害物质可由多种因素引入。食品污染物一方面来源于农药、杀虫剂、环境污染物、抗生素以及为应对食品需求增长而使用的药物等,另一方面则由食品携带或本身产生,如病原微生物污染、加工过程中生成的毒素和风险物质等,以上所列物质均对健康有害。因此,为了规范这些有害化合物的存在,需严格控制食品生产、加工和储存过程中相关物质的允许限量。

在食品风险物质检测方面,传统分析技术所面临的挑战包括食品样品中所含化合物种类多而复杂,目标化合物含量范围过宽以及基质自带的未知潜在毒性物质等。因此,在传统的食品分离分析中,需要经过复杂费时的前处理过程才能完成目标化合物的检测。在检测食品中风险物质方面,能够克服传统分析缺点的分析技术是重要的发展方向[13]。传统分析方法在分析食品污染物时由于样品前处理导致目标化合物丢失或转移从而降低准确性,食品安全分析中使用二维液相色谱方法可经过较少或不经过前处理步骤分析检测识别目标化合物,从而避免该类失误。

2.1 二维液相色谱在食品溯源方面的应用

Ianni等[14]采用中心切割二维液相色谱法,该二维系统采用反相色谱柱串联手性色谱柱组成,用于评估来自两头具有不同“加州乳腺炎测试”评分的奶牛的牛奶样品中丹磺酰化氨基酸对映体含量的变化,结果显示随着乳腺炎发展程度加重,丹磺酰化氨基酸含量水平逐渐降低,该结果可建立数学模型以用于早期乳腺炎的诊断。Alvim-Jr等[15]建立在线反相手性二维色谱系统串联三重四级杆检测器完成人乳中的氟西汀和诺氟西汀的含量检测,该研究结合RAM-BSA C18色谱柱与ChirobioticTMV2色谱柱,提供了一种具有高灵敏度、无基质效应、分析时间仅为25 min、几乎无需样品制备且溶剂用量较少(每次运行 10 mL)的方法,该方法成功应用于分析母乳样品,可用于药代动力学研究和常规药物监测。与Alvim-Jr同一课题组的Lopes等[16]将Alvim-Jr所建立的方法拓展至初乳样品中,并按照欧洲药品管理局指南完成方法验证。

指纹图谱技术可用于分离、识别和比较复杂样品的相关成分,二维液相指纹色谱可通过提供二维图像来实现相关功能。全二维液相色谱串联质谱可用于完成复杂样品非靶向指纹识别,以获得样品化合物信息的完整图谱。全二维指纹图谱对分析方法的分离参数要求较高,需在保证不丢失信息的情况下最大化实现复杂样品基质分离,同时要应对由于缺乏能够直接处理二维液相色谱提供的复杂原始数据的软件而导致的数据处理挑战。使用二维液相色谱方法来评估受保护的原产地名称(protected designation of origin,PDO)的真实性便是二维液相指纹图谱技术一种代表性应用。PDO是一项欧洲质量认证,由欧盟农产品检验认证机构颁发,授予具有良好固定品质(包括地理来源、加工和感官特性)的食品,该认证旨在保护成员国优质食品和农产品。来自卡拉布里亚(意大利)的甘草是具有高感官品质和丰富生物活性的化合物,已被认证为PDO产品。Montero等[17]开发亲水反相二维液相色谱方法,用于分析来自不同国家(意大利、中国、伊朗和阿塞拜疆)的甘草次级代谢产物,并与卡拉布里亚(意大利)的甘草次级代谢产物对比,ZIC-HILIC固定相用作第一维色谱柱,选择C18用作第二维色谱柱,该结果成功鉴定出可作为分析甘草地理来源评估的潜在标记物。

Zhang等[18]建立亲水反相二维液相色谱串联离子淌度四极杆飞行时间质谱完成43种红参和37种白参指纹图谱的建立和对比。该工作分析流程:第一步,确定24种人参皂苷标准品的碰撞截面值;第二步,使用人参皂苷数据库对检测到的化合物进行结构鉴定,结构鉴定所需关键参数为峰检测时间、强度阈值、质量准确度、碰撞截面值、耐受性和保留时间;第三步,使用Progenesis QI 2.1软件处理原始数据完成标志物检测;第四步,对检测到的离子进行光谱解卷积和归一化,获得包含保留时间、m/z 和归一化峰面积的数据矩阵;第五步,使用Ezinfo 3.0软件对所得矩阵进行化学计量学分析,化学计量学分析包括应用无监督主成分分析和监督正交偏最小二乘判别分析。该研究成功检测出用于区分红参和白参品种的9种人参皂苷,实现不同人参品种的溯源。

2.2 二维液相色谱在食品安全方面的应用

2.2.1 化学性危害

多环芳烃是食品中广泛存在的化学污染物之一,其在食品中的含量与食品来源有关,主要通过烹饪过程、工业食品加工或环境污染产生。多环芳烃具有毒性、致癌和致突变作用,其在食品中的存在易对人类健康产生不利影响。由于多环芳烃的结构多样导致其异构体数量多,因此分析该类化合物非常困难,二维液相色谱的强大分离能力可解决该问题。Nestola等[19]建立中心切割二维液相色谱串联气质联用色谱法分析多种食物基质中的多环芳烃,该系统中第一维色谱柱选择硅胶柱用于去除甘油三酯并保留多环芳烃和不饱和物成分,自动进入第二维去除不饱和物并完成多环芳烃分离,第二维组分进入气质联用仪完成定量分析检测。该研究提出了一种结合不同色谱分离策略分析多环芳烃的有效方法,成功用于检测橄榄油、葵花籽油、鸡蛋、番茄酱或蛋黄酱等样品中的多环芳烃含量。

食品中常见的化学性危害物还包括除草剂和抗生素等。Donato等[20]建立二维液相色谱法用于检测红酒中除草剂,在一维中使用氰基色谱柱,在二维中使用C18色谱柱。此外,为了增加两种分离机制之间的正交性,在第二维中使用了60 s的移动梯度。该工作除了检测红酒的酚类成分外,还检测到了痕量的除草剂灭草隆。通常认为在线二维液相色谱的局限性之一是灵敏度低,主要是由于分析物在二维色谱中受到流动相两次稀释;该成果中检测限(LOD)为1 mg/L,表明对葡萄酒中所含化合物的分离和定量具有非常高的选择性和灵敏度。Wang等[21]建立亲水反相二维色谱系统串联质谱检测器检测乳制品中七大类20种抗生素残留,该方法可一次性完成乳中多种抗生素残留检测,成功应用于5种乳粉、5种液态奶和5种生奶的抗生素含量测定。

2.2.2 生物性危害

真菌毒素是由曲霉属、青霉菌属和镰刀菌属等几种丝状真菌产生的一组低分子量的有毒次生代谢产物,该类化合物摄入后可在动物和人类中引起多种疾病。Campone等[22]成功开发中心切割二维液相色谱串联质谱法同时测定啤酒中的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2,伏马毒素B1、B2和赭曲霉毒素A的含量分析。该方法运行时间为37 min。选择两种啤酒对该方法进行了验证,可满足食品中霉菌毒素测定方法的相关标准(EC Decision 657/2002和Regulation(EC) No.401/2006)。与一维技术相比,该二维方法检测过程中干扰物显著减少,基质效应也大大减少。

食品溯源和安全是食品研究方向的一项重要议题,以上所述案例对于食品溯源和安全研究具有借鉴意义。

3 二维液相色谱在食品质量和添加剂方面的应用

3.1 二维液相色谱在食品质量方面的应用

食品质量是食品的重要标志性参数,控制食品质量才能保证其感官性质。调味品作为食品工业的一个重要方面,色谱技术已应用在调味品的化学物质基础表征方面[23-25]。二维液相色谱作为适合评价食品质量的技术,在该方面应用已较多。Pickrahn等[26]建立液相色谱和固相萃取制备结合方法(HPLC-SPE-HPLC)用于表征两种调味品大料提取物中的味觉成分,样品首先在第一维色谱中分离出16个组分,进而通过SPE完成溶剂替换,然后进入第二维色谱完成分离;该分离系统制备出的256个组分使用超高效液相色谱串联飞行时间质谱完成表征,表明该调味品的甜味主要由反式茴香脑提供,苦味由反式伪异丁香酚-2-甲基丁酸酯提供。

3.2 二维液相色谱在食品添加剂方面的应用

在食品工业界,不法商家会通过添加被禁止的成分来伪装成更高质量的产品,或是添加限量物质增强风味,色谱已应用于不同食品中添加剂的限量检测[27—28]。Hou等[29]开发了一种简便快速的停流速中心切割二维液相色谱方法,第一维使用C4色谱柱,第二维使用C18色谱柱,用于同时定量酸奶中的5种添加剂,包括阿斯巴甜、苯甲酸、那他霉素、糖精钠和山梨酸,该方法总分析时间为30 min,样品加标回收率在94.5%～103.9%之间。Hou等[30]建立中心切割二维液相色谱法分析牛奶和奶粉中的5种主要蛋白质(α-酪蛋白、β-酪蛋白、乳清蛋白、α-乳球蛋白、β-乳球蛋白)和7种添加剂(麦芽糖醇、乙基麦芽糖醇、香兰素、乙基香兰素、苯甲酸、山梨酸、糖精钠),该方法中第一维色谱能够将添加剂和蛋白质分成两组,呈现较高极性的添加剂从C4柱中快速洗脱并截留在捕集柱中以在第二维C18色谱柱中进一步分析,而蛋白质主要保留在第一维色谱柱中分析。添加单糖,如果糖、半乳糖或葡萄糖也是一种增强奶粉风味的掺假方法,Ma等[31]开发了一种二维液相色谱方法评估分析各种品牌和不同种类奶粉中单糖的存在,该方法使用无需样品前处理的中心切割二维液相色谱方法,研究对象包括全脂、脱脂和婴儿配方奶粉以及豆奶粉,该方法检测出部分奶粉样品中含有葡萄糖。

食品质量和添加剂对食品工业行业发展尤为重要,以上所述策略对于食品质量和真伪研究具有借鉴意义。

4 二维液相色谱在食品营养和健康方面的应用

由于食品是非常复杂的基质,因此它们的分离和表征非常困难。二维液相色谱可有效解决复杂基质分离分析过程中所遇到的挑战[32]。众所周知,食物的营养成分含量与其生物活性之间具有量化关系。现在食品科学领域的大部分研究涉及食品营养或食品健康。基于二维液相色谱在分离分析方面的优点,其在食品营养与食品健康方面应用前景广阔[33—34]。二维液相色谱适合表征和鉴定食品基质中存在的营养成分,这些化合物通常是微量成分[35—37]。采用非靶向分析对包含目标组分的基质进行全组分分析是理想的解决复杂基质中微量组分分离分析的手段[38]。

4.1 二维液相色谱在食品营养方面的应用

酚类化合物是水果饮品中的代表性营养调味物质,该类物质的色谱表征已较成熟[39]。Aly等[40]选择绿色环保溶剂替代部分传统溶剂建立在线全二维液相色谱分析鉴别葡萄汁和葡萄酒中的酚类化合物,这项研究首次尝试用绿色二维液相色谱,试图在不影响分离能力的情况下更环保地实现该类物质的分离分析。Brazdauskas等[41]采用综合二维液相色谱完成黑莓果渣中营养物质的化学表征,可分离出61种不同成分,可初步鉴定不同花青素、原花青素、黄酮类化合物和酚酸等营养调味物质。Montero等[42]建立亲水反相串联紫外质谱二维方法用于分析多个品种葡萄藤中的(多)酚类营养调味物质,首次在葡萄藤中检测出高度聚合的二苯乙烯类化合物,该方法显示出高峰容量(842)和良好的正交性(78%)。

二维液相色谱方法已广泛用于食品功能活性物质的制备,用于此目的的二维液相色谱配置通常是离线制备型二维液相色谱,该系统能够从第一维手动收集相对较大量的馏分,这些馏分可以适当浓缩并重新溶解,以便在第二维中进行分析。Fan等[43]建立制备型二维液相色谱方法用于分离甘草中黄酮类化合物,本成果中离线二维液相色谱成功用于纯化甘草中的低浓度物质,在16.8 h内纯化24种纯度高于90%的黄酮类化合物,表明离线二维制备色谱可用于分离活性营养成分用于活性研究。Zenezini等[44]建立二维液相色谱用于从驴奶中纯化肽,并对其进行表征,首先通过反相一维纯化具有抗氧化和血管紧张素转化酶抑制活性的驴奶肽,然后在第二维亲水色谱分离中进一步分析,通过筛选分离的肽的生物活性,其中两个显示出抗氧化活性,另外两个显示出血管紧张素转化酶抑制作用。

4.2 二维液相色谱在食品健康方面的应用

二维液相色谱方法也可用于在线筛选化合物生物活性,通常第一维中使用细胞膜色谱,色谱柱中填充研究生物活性的特定受体,第二维则是分离目标化合物。细胞膜色谱由细胞膜固定相组成,该固定相是将含有目标化合物特定受体的细胞膜固定在活性二氧化硅上制备所得。Cao等[45]采用该方法成功从3种药食两用物质中筛选出5种抗炎成分。

食品研究中,不仅食品成分重要,其相关的生物活性也很重要。以上所述策略对于食品营养和健康研究具有借鉴意义。

5 展望

综上所述,二维液相色谱是食品领域研究的一个非常有价值的工具。二维液相色谱方法在提高分辨率、获得化合物结构信息、易与质谱联用以及缩短样品制备时间方面具有明显优势。

尽管二维液相色谱在食品方面的应用已经比较广泛,但仍有较大的提升空间。接口技术、耐用性、定量、化学计量学、数据处理等的发展有助于提高二维液相色谱在食品分析方面的应用价值。未来,二维液相色谱将在食品调味营养物质表征、食品质量和食品安全等方面发挥巨大作用。