基于GC-IMS技术解析青枣不同菌种发酵关键风味物质差异

张江宁,叶峥,张爱凤

(山西农业大学山西功能食品研究院,太原 030031)

青枣果实有丰富的营养成分且清脆可口,富含维生素C、钙、磷、维生素B、胡萝卜素等,素有“维生素丸”之称[1-2]。食用适量青枣可以有效地促进食欲,促进肠道蠕动,缓解便秘,还可以增加血管的弹性,对于心脑血管疾病有一定的预防作用。

目前青枣加工产品较少,发酵是有效加工途径之一,果蔬经乳酸菌或酵母菌发酵不仅可以改善食品的风味,而且能代谢产生多种生物活性化合物并具有一定功能性[3-4]。因此,研究开发酵母菌和乳酸菌发酵青枣具有重要的意义[5]。

风味是发酵产品的关键指标之一,直接影响产品的可接受度、市场前景等,因此将风味纳入评价体系对新产品的开发具有重要意义[6-8]。传统通过感官评价风味主观性强,易出现偏差,目前可通过气相色谱-离子迁移谱技术实现风味定量分析,为产品风味的精准把控提供了条件。目前关于青枣风味成分的研究主要聚焦在青枣果酒和青枣果醋产品方面。原潞[9]采用顶空固相微萃取和气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)技术对青枣果酒发酵过程中的主要香气物质进行了鉴定。燕妮[10]采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)研究了青枣果醋发酵过程中有机酸的变化规律,研究表明果品原料经不同菌种发酵风味差异显著。目前对青枣经乳酸菌、酵母菌发酵后主要风味成分的研究较少,风味差异未见报道。

气相色谱-离子迁移谱(gas chromatography-ion mobility spectroscopy,GC-IMS)是一种分析技术,是以不同的气相离子在电场的作用下发生迁移且速率不同为基础,主要用于痕量气体以及化学离子物质表征的检测[11],进一步结合了气相色谱与离子迁移谱技术[12-14]。本研究以青枣汁、枣汁酵母菌发酵产品和枣汁乳酸菌发酵产品为研究对象,采用气相色谱-离子迁移谱方法,通过对不同样品间的谱图差异、指纹图谱以及动态主成分分析(principal component analysis,PCA)图和相似度分析图的比较,分析不同样品之间的风味物质差异,以期为青枣发酵产品开发的发展提供数据支撑和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

青枣:采自山西农业大学园艺学院太原枣园;乳酸菌、酵母菌:实验室自有。

苯酚、氢氧化钠、亚硫酸氢钠、氯化钾、偏重亚硫酸钾(K2S2O5)、3,5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、芥子酸(98%)、单宁酸(99%):均为分析纯,上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

1.3.1.2 乳酸菌、酵母菌单独发酵

Jiang G M等[31]用硫酸铁在640 ℃下焙烧含锌渣1 h，在硫酸铁/铁酸锌摩尔比为1.2的条件下，进行水浸提取有价值的金属硫酸盐进行回收，锌的回收率可达92.4%。

1.3 实验方法

Gallery Plot插件:通过比对指纹图谱,可以直观且定量地分析出不同样品之间的挥发性有机化合物的差异[17]。

1.3.1.1 青枣汁制备

称取500 g的青枣,清洗去核,按照料液比1∶5加入一定量水,打浆,过滤,滤液备用。

社会工作服务机构不但是社会福利服务的传递者，其还是社会公平与正义的维护者。社会工作服务机构能对创新社区治理的重要意义在于其在开展专业服务过程中发挥了政策倡导的功能，扮演着政策倡导者的角色。通过参与城市社区治理的过程，社会工作服务机构能够积极为服务对象提供专业服务和相应的政策性支持，呼吁改善或改变政策和规定中不合理的部分，保护服务对象的合法权益。因此，广西社会工作服务机构积极倡导开展政府购买社区社会工作服务的探索，建议加快推进社区社会工作岗位开发，提倡社会福利资源优先向边远贫困地区、边疆民族地区、革命老区、城市少数民族社区倾斜，努力推进广西社会工作事业的发展。

FlavourSpec®GC-IMS风味分析仪 德国GAS公司;JE2002电子天平(2 kg/0.01 g) 上海浦春计量仪器有限公司;MXT-5色谱柱(15 m×0.53 mm,1 μm) 美国Restek公司;SPX-300F小型生化培养箱 上海东麓仪器设备有限公司;HU-910IV-M多功能原汁机/榨汁机 韩国惠人公司;TGL-18M台式高速冷冻离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司。

VOCal:用于分析数据和谱图的定性和定量分析,同时应用软件中内置的NIST数据库和IMS数据库对挥发性有机物进行定性分析[15]。

将一定量青枣汁分别接种活化后的不同乳酸菌发酵剂(接种量0.5%)和酵母菌(接种量0.5%),其中,接种了乳酸菌的青枣汁置于35 ℃发酵罐中培养100 h,接种了酵母菌的青枣汁置于28 ℃培养箱中培养24 h。

姚晓冬的家乡在嘉兴，虽与兰溪同属江南，但两地的自然风貌还是有所不同。在姚晓冬看来，嘉兴是水乡，兰溪多丘陵，他说道：“除了花鸟以外，我也非常喜欢画山水，兰溪丘陵山泉的独特韵味很吸引我，所以常常来这里转转，找找感觉。多年来，也在兰溪交到了一些好朋友，可以说我与兰溪结下了不解之缘……我曾与其他好友一起在兰溪办过画展，但是个人作品展，这还是第一次。希望通过这次展览的机会，与更多的书画爱好者有一次密切的交流和互动。”。

1.3.2 色谱条件

1.3.2.1 气相色谱-离子迁移谱(GC-IMS)分析

取1 mL样品并转移至20 mL顶空进样瓶中。自动顶空进样单元见表1。

表1 自动顶空进样单元Table 1 Automatic headspace sampling unit

Dynamic PCA插件:动态PCA和相似度分析图,用于样品的聚类分析和相似度分析,并可迅速确定未知样品的种类[18]。

【剧情回顾】《天龙八部》里的“六脉神剑”乃大理段氏的最高武学，由不同的手指隔空激发内力，变化精微。吐蕃国师鸠摩智就是为了抢到这门绝学，一直苦苦纠缠男主角段誉。

MXT-5色谱柱(15 m×0.53 mm,1 μm);柱温60 ℃;载气/漂移气:N2;IMS温度:45 ℃。

1.3.2.3 IMS条件

漂移气为N2;漂移气流速为150 mL/min。

1.4 数据处理

2) 压载水中3种致病菌的分布具有鲜明的特点，即随压载水深度的增加菌落数量与检出率逐渐增加，且随时间推移此态势明显加强，其间若发生压载水置换行为或水龄<10 d时则这一势态不明显。

Reporter插件:直接比较样品间的谱图差异(二维俯视图、三维谱图和差异谱图)[16]。

要在重视学校创新创业教育的基础上加大社区创客教育与高校创新创业教育的联动机制，激发合力，努力将社区创新教育糅合到社会经济结构的各个环节中去，不断进化和完善社区教育体制，构建社区教育资源共享机制［1］。

学生希望可以通过自己的发现、研究和探索得到答案，但是在传统教学模式中，教师往往都将问题及其解决方式提前准备好，直接提供给学生，这并不利于学生的个性化发展，机械式的解决问题，会使所有探索行为变得毫无意义。因此，教师应当结合新课改的三维教学目标，将知识和能力的培养放在同等重要的地位，让学生在获取数学知识的过程中，能够有效利用这些知识，全面提升小学生的数学学习能力和数学综合素质。

1.3.1 样品的前处理

我国校园足球竞赛多以学校为基本参赛单位，这会导致足球竞赛成绩优势学校与劣势学校差距进一步加大，影响学校参赛积极性，造成劣势学校优秀足球人才流失。建议增设以区级、市级、省级为单位的校园足球竞赛体系，尤其是以区为单位的校园足球赛事，促进片区内学校间足球优势资源共享，将散落于区域内的各学校优秀球员集中起来，为他们提供一同训练与比赛的机会，通过高水平校园足球竞赛体系的构建，也为职业足球发现与选拔基层青少年人才提供平台。

1.3.2.2 GC条件

2 结果与分析

2.1 对比样品的挥发性有机物差异(GC-IMS图谱分析)

应用VOCal分析软件中的Reporter插件程序对青枣汁、枣汁酵母菌发酵产品和枣汁乳酸菌发酵产品中的挥发性成分进行三维对比,得到GC-IMS三维谱图(保留时间、迁移时间和峰强度,见图1),可以看出不同样品风味物质的差异[19-22]。与此同时,进一步降低数据维度,得到俯视图(见图2),进行差异对比。横坐标1.0处的竖线为RIP峰(反应离子峰),RIP峰两侧的每个点代表一种挥发性有机化合物。颜色表示物质的浓度,浅色表示浓度较低,深色表示浓度较高,颜色越深表示浓度越大[23-24]。将样品0作为对照,在剩下的谱图中去除样品0中的信号峰,从而得到二者的差异谱图(见图3)。

图1 样品的三维谱图Fig.1 Three-dimensional spectrogram of samples

图2 样品的GC-IMS谱图(俯视图)Fig.2 GC-IMS spectra of samples (top view)

图3 样品的GC-IMS谱图(差异图)Fig.3 GC-IMS spectra of samples (difference diagram)

2.2 样品中的挥发性有机物指纹图谱对比

应用VOCal分析软件中的Gallery Plot插件程序,对鲜枣汁(样品1)、枣汁酵母菌发酵产品(样品2)和枣汁乳酸菌发酵产品(样品3)的指纹图谱进行对比分析,可以分析出不同样品间的风味物质差异[25]。由图4可知,在a区域中,样品1富含2-甲酰基-5-甲基噻吩、6-甲基-5-庚烯-2-酮、丙酮、3-戊酮、2-甲基-1-丁醇、二甲基二硫醚、1-丙醇、丁酸甲酯、苯乙烯等风味物质,而样品2和样品3相对缺少这些风味物质。b区域中,样品2富含Z-3-己烯-1-醇、异丁醇、1-辛烯-3-醇、乙酸异戊酯、乙酸异丁酯、异丁酸乙酯、丙酸乙酯、己醛等风味物质,而样品1和样品3相对缺少这些风味物质。c区域中,样品3富含3-甲基丁酸、2-戊酮、羟基丙酮、甲醇等风味物质,而样品1和样品2相对缺少这些风味物质。根据指纹图谱还可以得出:样品1和样品3的共同风味物质有环己烯-2-酮;样品2和样品3的共同风味物质有2,3-戊二酮、己酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙缩醛[26-27]。

图4 样品的Gallery Plot图(指纹图)Fig.4 Gallery plot of samples (fingerprint)

通过整理不同样品中的物质出峰位置及峰体积数据可以准确地得知:样品1中6-甲基-5-庚烯-2-酮、2-辛酮、3-戊酮、2-甲基丁醛、E-2-庚烯醛、E-2-己烯醛、二甲基二硫醚、苯乙烯、苯、2-甲基-1-丁醇、1-丙醇、丁酸甲酯、丙酸、甲基吡嗪等物质的含量较高;样品2中苯乙醛、2,3-二乙基-5-甲基吡嗪、1-辛烯-3-醇、Z-3-己烯-1-醇、2-辛醇、异丁醇、异戊醇、己醛、乙酸异戊酯、乙酸异丁酯、异丁酸乙酯、丙酸乙酯等物质的含量较高;样品3中己酸乙酯、甲酸乙酯、2-戊酮等物质的含量较高[28]。

2.3 样品的聚类分析(动态主成分分析PCA)

由图5可知,青枣汁、枣汁酵母菌发酵产品和枣汁乳酸菌发酵产品3种样品中各个区域内点之间的离散度都较小。青枣汁位于PC1的正向轴,枣汁酵母菌发酵产品和枣汁乳酸菌发酵产品都位于PC1的负向轴,且三者距离都很远,表明青枣汁、枣汁酵母菌发酵产品和枣汁乳酸菌发酵产品三者的风味存在较大差异。由动态主成分分析图可知,两种主成分累计贡献率为99%,这表明PCA分析既能有效地反映出样品的整体信息,又能较好地区分出加入不同菌种的青枣发酵样品[29]。

图5 样品的PCA分析图Fig.5 PCA analysis diagram of samples

由图6可知,枣汁酵母菌发酵产品、枣汁乳酸菌发酵产品和青枣汁样品的距离都很远,说明3种样品的相似度较低,因此,3种样品的风味相对来说差异较大。

图6 样品的最近邻-欧氏距离图(距离越近,相似度越高)Fig.6 Nearest neighbor-Euclidean distance diagram of samples (the closer the distance, the higher the similarity)

2.4 样品的挥发性有机物定性分析(GC×IMS Library Search)

通过匹配GC-IMS数据库,进而定性分析样品中的挥发性有机物,见图7～图9。

李金枝的话把我弄糊涂了，我赶紧顺着李金枝手指的方向看去。我脑袋里嗡了一下。即使没戴眼镜，我也知道自己是光着身子的。为了确认事实，我又用手摸了摸自己。坏了，真坏了，不仅光着身子，而且光得非常彻底，真正的一丝不挂。

图7 青枣汁样品气相离子迁移Fig.7 Gas phase ion migration of green jujube juice samples

图8 枣汁酵母菌发酵样品气相离子迁移Fig.8 Gas phase ion migration of jujube juice samples fermented by yeast

图9 枣汁乳酸菌发酵样品气相离子迁移Fig.9 Gas phase ion migration of jujube juice samples fermented by lactic acid bacteria

由图7～图9可知,青枣汁、枣汁酵母菌发酵产品和枣汁乳酸菌发酵产品3种样品都有45个挥发性化合物特征峰位置点。整理表2数据,共计检测出44种挥发性成分,其中包括酯类9种、醇类11种、酮类8种、烯类1种、醛类8种、羧酸类2种、其他5种,其中一种化合物同时检出了单体和二聚体,即辛酸乙酯[30]。

表2 鉴别不同样品中的挥发性成分Table 2 Identification of volatile components in different samples

3 结论与讨论

本文采用GC-IMS技术对青枣汁、枣汁酵母菌发酵产品和枣汁乳酸菌发酵产品进行挥发性有机物组成分析,根据挥发性有机物定性分析(GC×IMS Library Search)共计检测出44种风味物质[31];采用气相色谱-离子迁移谱技术构建挥发性有机物的风味指纹图谱,获得了不同样品的挥发性化合物指纹谱图,由此得出:鲜枣汁中6-甲基-5-庚烯-2-酮、2-辛酮、3-戊酮、2-甲基丁醛、E-2-庚烯醛、E-2-己烯醛、二甲基二硫醚、苯乙烯、苯、2-甲基-1-丁醇、1-丙醇、丁酸甲酯、丙酸、甲基吡嗪等物质的含量较高;枣汁酵母菌发酵产品中苯乙醛、2,3-二乙基-5-甲基吡嗪、1-辛烯-3-醇、Z-3-己烯-1-醇、2-辛醇、异丁醇、异戊醇、己醛、乙酸异戊酯、乙酸异丁酯、异丁酸乙酯、丙酸乙酯等物质的含量较高;枣汁乳酸菌发酵产品中己酸乙酯、甲酸乙酯、2-戊酮等物质的含量较高。采用动态主成分分析(PCA)方法对样品进行聚类分析,可以有效地区分添加不同菌种的青枣汁发酵样品。根据样品的最近邻-欧氏距离图可以看出,枣汁酵母菌发酵产品、枣汁乳酸菌发酵产品和青枣汁样品的距离都很远,由此表明3种样品的相似度较低,风味相对来说差异较大,为青枣发酵产品的相关研究提供了新的理论依据和数据支持[32-33]。