蚕豆酱发酵过程微生物群落结构及其功能分析

曾丽丽,聂珍珍,李紫阳

(1.永城职业学院,河南 商丘 476600;2.东北财经大学,辽宁 大连 116012)

豆类发酵产品是一种传统的调味品,深受东南亚地区消费者喜爱[1-2]。随着社会的发展,国内外的酱类类别和品牌逐渐多样化,主要包括蚕豆酱、面酱、酱油、腐乳和黄豆酱等[3],这些豆类调味品的主要原材料为小麦、大豆和蚕豆等[4-5]。蚕豆酱又被称为豆瓣酱,主要由蚕豆和面粉组成[6],先将其使用米曲酶进行发酵后再制成调味酱[7]。

传统的蚕豆酱发酵使用半开放式的多菌种混合发酵加工工艺,包括霉菌制曲和盐水发酵两个阶段[8-9]。先将原料高温处理,之后进行淀粉糊化和蛋白质变性[10],进行人工接种,再将接种好的原料混匀进行自然发酵[11];蚕豆酱在微生物作用下,很多大分子物质被分解成小分子的氨基酸、多肽和糖类物质[12-13],形成具有独特酱香风味的调味酱[14]。

高盐浓度和微酸环境是蚕豆酱的特征,高盐环境不仅增强了人们对蚕豆酱的食欲[15],而且抑制了蚕豆酱中微生物生长,延长了蚕豆酱的储藏时间[16];蚕豆酱发酵过程中蛋白酶和淀粉酶的降解、氨基酸态氮和还原糖的生成都直接影响蚕豆酱中风味成分的形成[17]。

本研究通过分析蚕豆酱的理化性质随着发酵时间延长的变化情况,再利用宏基因技术对发酵过程中蚕豆酱中的真菌和细菌群落多样性和丰富度进行研究,为蚕豆酱发酵技术和工厂化加工奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

选用来自同一批次的发酵蚕豆酱,其发酵时间依次为0,1,2,3,4,5,6,13,20,27,34,41,48,55 d,获得样品后,将样品置于-80 ℃冰箱中保存待用。

试剂:水杨酸、苯酚、甲醛、氯化钠、盐酸、硫酸锌、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、氢氧化钠和硝酸钾。

1.2 试验仪器

PCR仪、分光光度计、凝胶成像仪、气相色谱-质谱联用仪、萃取头、pH计、高速冷冻离心机和高效液相色谱仪。

1.3 试验方法

1.3.1 理化指标及挥发性成分测定

采用硝酸银滴定法测定盐度;使用pH计测定pH值;采用酸碱滴定法和甲醛滴定法测定可滴定酸度和氨基酸态氮含量;采用福林酚-法测定蛋白酶活性;采用二硝基水杨酸测定葡萄糖淀粉酶活性;采用HPLC法测定游离氨基酸和有机酸含量。

1.3.2 宏基因测序

使用DNA试剂盒提取DNA,然后用琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的纯度和完整性。将提取的DNA送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析。

1.3.3 数据处理及分析

利用SPSS软件和Excel软件对数据进行整理和分析。

2 结果和讨论

2.1 理化指标和风味分析

2.1.1 理化指标的跟踪分析

由图1可知,蚕豆酱发酵过程中水分含量先增加后变化不大。当发酵时间小于6 d时,蚕豆酱中的水分含量快速增加,当发酵至第6天时,蚕豆酱中的水分含量为58%。当发酵时间大于6 d时,蚕豆酱中的水分含量基本为57%～58%,即使发酵时间不断增加,蚕豆酱中的水分含量也不再发生变化。

图1 蚕豆酱发酵过程中水分含量的变化情况Fig.1 Change of moisture content during thefermentation of broad bean paste

由图2可知,当发酵时间小于6 d时,蚕豆酱的盐度随着发酵时间的增加而逐渐增加。当发酵至第6天时,蚕豆酱的盐度为12%;当发酵时间大于6 d时,蚕豆酱的盐度呈现上下波动的趋势,但基本保持稳定,盐度维持在12%～14%之间。

图2 蚕豆酱发酵过程中盐度的变化情况Fig.2 Change of salinity during the fermentation of broad bean paste

由图3可知,随着发酵时间的增加,蚕豆酱的pH值呈现下降趋势。当发酵时间小于6 d时,蚕豆酱的pH值快速降低。当发酵时间大于6 d时,蚕豆酱的pH值开始缓慢降低。当蚕豆酱发酵刚开始时,蚕豆酱中的可滴定酸度为3%,随着发酵时间的增加,蚕豆酱中的可滴定酸度逐渐增加。

图3 蚕豆酱发酵过程中可滴定酸度和pH值的变化情况Fig.3 Changes of titratable acidity and pH value during the fermentation of broad bean paste

由图4可知,随着发酵时间的增加,蚕豆酱中氨基酸态氮含量缓慢增加;当发酵时间小于6 d时,蚕豆酱中的氨基酸态氮含量快速增加;当发酵时间大于6 d时,蚕豆酱中的氨基酸态氮含量仍呈现增加趋势,但是增加的幅度较小。

图4 蚕豆酱发酵过程中氨基酸态氮含量的变化情况Fig.4 Change of amino acid nitrogen content during the fermentation of broad bean paste

由图5可知,蚕豆酱发酵过程中,还原糖呈现先增加后波动不大的趋势,当发酵时间小于6 d时,蚕豆酱中的还原糖含量快速增加,从13%增加到25%;当发酵时间大于6 d时,蚕豆酱中的还原糖含量维持在25%～26%,基本保持不变。

图5 蚕豆酱发酵过程中还原糖含量的变化情况Fig.5 Change of reducing sugar content during the fermentation of broad bean paste

由图6可知,随着发酵时间的增加,蚕豆酱中的蛋白酶活性和葡萄糖淀粉酶活性呈现不断下降的趋势。当发酵时间小于6 d时,蚕豆酱中蛋白酶活性和葡萄糖淀粉酶活性快速下降,随着发酵时间的继续增加,蚕豆酱中的蛋白酶活性和葡萄糖淀粉酶活性下降的速度逐渐缓慢。

图6 蚕豆酱发酵过程中蛋白酶和葡萄糖淀粉酶活性的变化情况Fig.6 Change of protease and glucoamylase activities during the fermentation of broad bean paste

图7 非挥发性有机酸随发酵时间的变化情况Fig.7 Change of non-volatile organic acids with fermentation time

由图1～图6可知,当蚕豆酱发酵时间小于6 d时,蚕豆酱中微生物快速繁殖,导致蚕豆酱中的水分、盐度、可滴定酸度、氨基酸态氮和还原糖含量快速增加;随着发酵时间的继续增加,蚕豆酱中的水分、盐度、可滴定酸度、氨基酸态氮和还原糖含量缓慢增加或基本保持不变。

2.1.2 风味代谢跟踪分析

蚕豆酱中的非挥发性有机酸包括乙酸和乳酸,当发酵时间小于13 d时,蚕豆酱中的非挥发性有机酸含量呈现先升高后降低的趋势;蚕豆酱中的乙酸含量基本为3～15 g/kg,乳酸含量为17～55 g/kg;当发酵时间为20～55 d时,蚕豆酱中的乳酸和乙酸含量呈现先升高后降低的趋势。

由图8可知,随着发酵时间的增加,蚕豆酱中挥发性风味成分不断增加。蚕豆酱中挥发性风味成分主要包括醇类、酯类、醛类、酮类、酚类和酸类等。蚕豆酱中挥发性风味成分含量较高的包括醇类和酯类,其随着发酵时间的增加而不断增加,而其他挥发性风味成分醛类、酮类、酚类和酸类等含量较少,随着发酵时间的增加,这些挥发性风味成分无明显变化。

图8 挥发性风味成分随发酵时间的变化情况Fig.8 Change of volatile flavor components with fermentation time

2.2 微生物群落多样性分析

通过扩增子测序方式对蚕豆酱中的细菌和真菌群落进行分析,结果见表1,样品的覆盖率均为100%,说明数据的深度和质量较可靠。

表1 Illumina 测序的统计信息Table 1 Statistics of Illumina sequencing

表2 蚕豆酱发酵过程中的优势属Table 2 Dominant genera in the fermentation process of broad bean paste

通过对蚕豆酱中的真菌和细菌多样性指数Shannon、Chao 1和观测点进行分析,发现蚕豆酱中细菌群落在发酵第1天时多样性最大、丰富度最高,之后随着环境压力及胁迫增强,蚕豆酱中的细菌群落多样性和丰富度开始降低。蚕豆酱中真菌多样性和丰富度的变化呈上下波动趋势,多样性及丰富度变化并不明显。

由图9和图10可知,随着发酵时间的增加,蚕豆酱中的细菌和真菌群落结构趋于稳定。

图9 蚕豆酱发酵过程中细菌群落的聚类分析Fig.9 Clustering analysis of bacterial community during the fermentation of broad bean paste

图10 蚕豆酱发酵过程中真菌群落的聚类分析Fig.10 Clustering analysis of fungal community during the fermentation of broad bean paste

2.3 微生物群落的组成及定量分析

微生物是蚕豆酱发酵的重要组成部分,在蚕豆酱发酵过程中发挥着不可替代的作用,通过对蚕豆酱样品进行统计分析,发现相对丰富度大于1%的细菌种类包括葡萄球菌属、芽孢杆菌属、魏斯氏菌属、未分类A属和B属;相对丰富度大于1%的真菌种类包括曲霉属和接合酵母属。

3 小结

微生物生长发育受季节性的影响,随着豆酱发酵的不断进行[18-19],豆酱中的微生物群落呈现相互交替,从而发生一系列的生化反应,影响蚕豆酱食品的质量[20]。本研究对发酵蚕豆酱中各种理化性质进行了分析和研究,结果表明,蚕豆酱发酵初期微生物快速繁殖,导致蚕豆酱中的水分、盐度、可滴定酸度、氨基酸态氮和还原糖含量快速增加;随着发酵时间持续增加,蚕豆酱中的水分、盐度、可滴定酸度、氨基酸态氮和还原糖含量缓慢增加或基本保持不变。

通过宏基因技术对发酵过程中蚕豆酱的微生物群落进行分析,结果表明,发酵刚开始时,蚕豆酱中的细菌多样性和丰富度较高,随着发酵时间的增加,蚕豆酱中的细菌群落基本保持稳定;而发酵时间的长短对蚕豆酱中的真菌群落变化影响不明显。当发酵结束时,蚕豆酱中的主要微生物类群且丰富度大于1%的细菌种类包括葡萄球菌属、芽孢杆菌属、魏斯氏菌属、未分类A属和B属;相对丰富度大于1%的真菌种类包括曲霉属和接合酵母属。