针刺太冲穴对肝阳上亢型偏头痛大鼠血清血管活性物质含量的影响

林淑芳 王嘉驹 陈 白 曹丽萍 姚娟娟 江一静

(1 福建中医药大学附属康复医院,福州,350003; 2 福建省康复技术重点实验室,福州,350003; 3 兰州大学,兰州,730000)

偏头痛是一种反复发作的可致残的神经血管性疾病,全球超过10亿人受偏头痛困扰[1],发作时剧烈的搏动性疼痛,伴随畏光、恶心及呕吐等症状严重影响患者的日常生活[2]。目前临床所用药物虽然能减少偏头痛的发作频率,但伴随着睡眠障碍、代谢紊乱或肝脏损害等不良反应[3],与药物比较,针刺能有效、安全地预防和治疗偏头痛[4],缓解疼痛[5],改善大脑功能[6]。降钙素基因相关肽(Calcitonin Gene-related Peptide,CGRP)、5-羟色胺(5-hydroxy Tryptamine,5-HT)及肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)等神经递质和血管活性物质参与了偏头痛的病理生理过程;CGRP是偏头痛的发生和发展过程中重要的血管活性肽之一,参与痛觉信息传递、外周和中枢敏化,有强烈的舒血管作用,可产生搏动性疼痛[7];5-HT是单胺类小分子神经递质,参与偏头痛的痛觉调制,当5-HT神经元活动增强时,痛阈升高,产生镇痛作用[8];TNF-α是一种炎症介质,并且有神经递质效应,参与偏头痛神经源性炎症反应[9]。肝阳上亢证在偏头痛的证候分型中最常见[10],本课题组前期观察证实针刺双侧太冲穴可明显改善肝阳上亢偏头痛患者疼痛情况和生命质量[11],但其机制尚不明确。因此,本研究以肝阳上亢偏头痛大鼠为研究对象,观察针刺双侧太冲穴对偏头痛大鼠血清CGRP、5-HT及TNF-α含量的影响,为临床针刺太冲穴治疗肝阳上亢型偏头痛提供机制研究参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康无特定病原体(Specific Pathogen Free,SPF)级雄性斯泼累格·多雷(Sprague Dawley,SD)大鼠50只,体质量(200±20)g,购自浙江省医学科学院[许可证号:SCXK(浙)2018-0004],在福建中医药大学实验动物中心动物房喂养,饲养环境温度恒定于22 ℃,湿度恒定于50%,光暗周期为12 h,自由摄食、饮水。整个实验过程中参考《关于善待实验动物的指导性意见》[12]为处理动物的参考,符合实验动物伦理学原则,经福建中医药大学伦理委员会批准同意(伦理审批号:FJTCM IACUC 2022054)。

1.1.2 仪器与试剂 华佗牌一次性无菌针灸针(苏州医疗用品厂有限公司,0.25 mm×13 mm,批号:200135),高速冷冻离心机(Eppendorf公司,德国,型号:5810R),自动平衡离心机(Eppendorf公司,德国,型号:5430R),全自动酶标仪(Bio-Tek公司,美国,型号:Elx800),恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司,型号:HWS24);硝酸甘油注射液(广州白云山明兴制药有限公司,批号:1210901),CGRP试剂盒(上海西唐生物科技有限公司,货号:F15261),5-HT试剂盒(上海西唐生物科技有限公司,货号:F16771),TNF-α试剂盒(上海西唐生物科技有限公司,货号:F15710)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 适应性喂养1周后,将50只SD大鼠随机分为空白对照组(n=10)、模型组(n=40),模型组大鼠以附子汤灌胃结合颈肩部皮下注射硝酸甘油建立肝阳上亢偏头痛模型,其中30只大鼠成模,将成模的大鼠随机分为模型组、太冲组、非穴组,每组10只。本研究以附子汤灌胃结合注射硝酸甘油方法复制肝阳上亢偏头痛模型[13-14]。将20 g制附子浸泡30 min,煎煮2次后将药液混合,浓缩为含生药0.1 g/mL的附子浓缩液,以20 mL/(kg·d)的剂量连续灌胃21 d,当大鼠出现眼结膜颜色变红,抓尾时尖叫、惊跳甚至咬人等易激惹表现时提示肝阳上亢模型复制成功;再用0.9% NaCl硝酸甘油注射液稀释成浓度为2 mg/mL溶液,以10 mg/kg算出每只SD大鼠所需注射的剂量,用5 mL注射器抽取相对应剂量溶液,在大鼠右肩颈部皮下缓缓注射,1次/d,共5 d;注射硝酸甘油后,SD大鼠出现耳红,爬笼以及前肢挠头连续超过5次以上等烦躁不安次数增加的症状,为偏头痛模型制作成功。

1.2.2 干预方法 空白对照组:普通笼中饲养,每次抓取后无任何治疗。模型组:建模成功后普通笼中饲养,每次抓取后无任何治疗。太冲组:行为学观察1 h后,针刺双侧太冲穴(定位参考实验大鼠腧穴图谱[15]),用0.25 mm×13 mm的一次性无菌针灸针直刺2～3 mm,捻转泻法1 min,每10 min行针1次,留针30 min。非穴组:行为学观察1 h后,针刺双侧肋下固定非穴点(双侧髂嵴直上10 mm处),约30°斜刺2～3 mm,行针手法同太冲组。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 行为学 观察偏头痛大鼠耳红持续时间及针刺前后挠头和爬笼次数:观察造模后大鼠耳红出现直至消失的持续时间;在针刺前、针刺后1 h、针刺后2 h共3个时间段分别记录挠头、爬笼次数,针刺治疗期间不记次。

1.2.3.2 血清CGRP、5-HT、TNF-α的含量 酶联免疫吸附试验法检测偏头痛大鼠血清中CGRP、5-HT、TNF-α的含量:行为学观察完毕后,检测血清中CGRP、5-HT、TNF-α含量。经腹腔注射0.3%戊巴比妥钠(1 mL/100 g)麻醉大鼠,腹主动脉采血约1 mL放入预冷的试管,加入10%乙二胺四乙酸钠15 μL混匀,在高速冷冻离心机中以12 000×g,离心15 min,分离血浆后取上层血清分装于冻存管,置于-80 ℃冰箱保存待测。按ELISA试剂盒说明书稀释标准品,每孔加样品50 μL(空白孔不添加标准品和待测样品),在设定37 ℃恒温箱中温育30 min;配液后每孔反复加入洗涤液并拍干,反复5次;每孔加入50 μL酶标试剂(空白孔不添加),再次在设定37 ℃恒温箱中温育30 min;洗涤后显色,分别加入显色剂A 50 μL、显色剂B 50 μL,在避光37 ℃环境中反应15 min,每孔加入终止液50 μL终止后测定,选取波长为450 nm,将待测品放入酶标仪检测,根据标准品的浓度及测得的吸光度(A)值计算出对应的样品浓度。

2 结果

2.1 各组大鼠造模后行为学观察 空白对照组无耳红,模型组、太冲组及非穴组均在注射硝酸甘油后4 min左右出现耳红,3 h左右后消失;与模型组、非穴组比较,太冲组大鼠耳红持续时间明显较短(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠造模后耳红出现时间和消失时间比较

空白对照组在各时间段内偶尔出现几次挠头、爬笼。针刺前,与空白对照组比较,模型组、太冲组及非穴组大鼠挠头、爬笼次数明显增多(P<0.05);模型组、太冲组、非穴组之间挠头及爬笼次数差异无统计学意义(P>0.05)。针刺干预后1 h、2 h,与模型组、非穴组比较,太冲组大鼠挠头、爬笼次数均明显减少(P<0.05)。见图1。

2.2 各组大鼠血清中CGRP、5-HT、TNF-α含量比较 与空白对照组比较,模型组大鼠血清中CGRP、TNF-α含量明显增高(P<0.05),5-HT含量明显降低(P<0.05);与模型组、非穴组比较,太冲组大鼠血清中CGRP、TNF-α含量明显减少(均P<0.05),5-HT含量明显增多(均P<0.05)。见表2,图2。

图2 各组大鼠治疗后血清CGRP、5-HT、TNF-α含量比较注:与空白对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,△P<0.05;与非穴组比较,▲P<0.05

表2 各组大鼠治疗后血清CGRP、5-HT、TNF-α含量比较

3 讨论

偏头痛属中医学“偏头风”“头风”等病症范畴。偏头痛与肝关系密切,多从肝论治[16];文献分析证实,在偏头痛的辨证分型中,肝阳上亢证最为常见[10],肝气主升,体阴而用阳,肝阳偏亢生发太过,阴不制阳,导致偏头痛,宜平肝通络止痛。“气有余于上者,导而下之”,太冲穴可平肝潜阳,疏调气血运行,且为肝经输穴主疼痛,缓解偏头痛临床症状[11,17]。太冲穴分布有腓浅神经、皮神经、趾背动静脉及足背静脉网,且在大脑皮质功能投影范围较广,可调节大脑皮质功能[18]。研究发现,针刺太冲穴可迅速显著地调节偏头痛患者的脑血流量,这是太冲穴作为肝阳上亢偏头痛最常用的远端取穴的原因之一[19]。三叉神经血管学说是偏头痛发病机制研究的主要学说之一,该学说认为偏头痛发作产生的神经源性炎症反应与CGRP、5-HT、TNF-α等血管活性物质密切相关[20-21]。课题组前期研究已证实针刺双侧太冲穴对肝阳上亢偏头痛的临床疗效,因此,本研究从血管活性物质角度探讨针刺太冲穴治疗肝阳上亢偏头痛的作用机制。

CGRP是重要的血管活性神经肽,是三叉神经血管反射学说中引起神经源性炎症反应的重要舒血管物质。研究发现,偏头痛患者发作期血清CGRP水平明显高于正常人[22];临床和实验研究证实静脉或腹腔注射CGRP会诱发偏头痛发作[23-24],而降低外周血CGRP活性可抑制三叉神经敏化,有效缓解偏头痛发作[25];临床研究发现针刺可降低偏头痛患者血清中CGRP水平[26],本研究再次证实这一结论。本研究中,针刺前大鼠血清中CGRP含量升高,针刺太冲穴后与针刺非穴比较,针刺太冲穴的大鼠血清CGRP含量明显降低,说明针刺太冲穴可通过减少血清CGRP含量缓解偏头痛。有学者在太冲穴区的显微结构中发现穴区内细小血管与CGRP阳性神经纤维相伴行,这或许是针刺太冲穴起效的物质基础之一[27]。

5-HT通过与不同受体结合介导脑膜血管舒缩、神经源性炎症反应、痛觉信息传递等途径调制痛觉,对偏头痛有双向的影响[28]。临床研究发现,针刺通过提高偏头痛患者血清中5-HT含量参与镇痛过程[29];针刺使5-HT受体高表达,激活5-HT,从而抑制CGRP的释放,治疗偏头痛[30]。本研究显示,偏头痛模型大鼠血清5-HT较正常大鼠明显偏低,针刺太冲后血清5-HT明显上升,这与上述研究结果一致,可见,提高偏头痛血清5-HT含量是针刺太冲穴起镇痛作用的途径之一。

炎症介质TNF-α参与偏头痛神经源性炎症反应过程,三叉神经节神经元释放的CGRP可促进卫星细胞释放TNF-α,而TNF-α可反作用于大鼠三叉神经节神经元进一步促进CGRP分泌和表达[31]。有研究报道,TNF-α在偏头痛大鼠三叉神经节内显著表达[32],而TNF-α抑制剂能明显减轻神经病理性疼痛[33],认为TNF-α可能是偏头痛治疗的潜在靶点。本研究显示,偏头痛模型大鼠血清TNF-α含量明显升高,这与另一研究结果相符[34];与针刺非穴比较,针刺太冲穴可显著降低血清TNF-α含量,针刺太冲穴治疗偏头痛具有穴位特异性。

综上所述,针刺双侧太冲穴可通过降低血清CGRP、TNF-α含量,提高血清5-HT含量治疗肝阳上亢偏头痛。针刺太冲穴可能通过调节外周血相关血管活性物质参与偏头痛,以此为基础,本课题组将进一步深入研究针刺太冲穴对偏头痛三叉神经血管系统的中枢调控机制。

利益冲突声明:无。