航天诱变野大豆SP1群体苗期耐盐性鉴定与评价

徐宗昌，鲁雪莉，魏云冲，孟晨，张梦超，张缘杨，王萌，王菊英，张成省，李义强*

（1. 中国农业科学院烟草研究所海洋农业研究中心，山东 青岛 266100；2. 青岛农业大学农学院，山东 青岛 266109；3. 山西农业大学农学院，山西 晋中 034100；4. 国家盐碱地综合利用技术创新中心，山东 东营 257345；5. 青岛市滨海盐碱地资源挖掘与生物育种重点实验室，山东 青岛 266100）

土壤盐渍化是制约现代农业发展的世界性难题之一，一般情况下能够导致作物减产15%～20%，严重的甚至绝产［1］。世界范围内超过100 多个国家的近20%的耕作土地正在遭受土壤盐渍化的威胁［2］。中国盐渍化土地面积约有3600 万hm2，约占全国可利用土地资源的4.88%［3］，是非常重要的后备耕地资源。培育耐盐作物品种、牧草品种是提高盐渍化土地利用程度的重要方式。

航天诱变是指利用返回式卫星或载人飞船搭载生物材料进入太空环境，利用外太空微重力、强辐射以及弱地磁等诱导生物材料产生可遗传变异的一种特殊的诱变育种手段。相较于传统育种方式动辄10 年起步的育种周期而言，航天诱变新品种育成平均5 年，通常在第3、4 代性状就开始稳定［4］，育种周期大大缩短。因此，自20 世纪60 年代初期，苏联学者开始进行航天诱变研究以来，美国、中国等国家相继开展了航天诱变育种工作［5-6］。目前，我国的航天育种技术走在世界前列，已经开展了包括农作物、蔬菜、花卉、牧草、中药材、木本植物等在内的上千个植物材料的诱变工作，育成品种500 多个，累计推广面积超过13.33 万hm2［7-10］，极大地丰富了各种作物品种资源和遗传背景。

野大豆（Glycine soja）是栽培大豆的近缘野生种，起源于中国，在国内各省份分布广泛。野大豆籽粒营养丰富，富含蛋白质、脂肪以及异黄酮等功能活性物质，药用食用均可［11］；茎细而软，粗纤维含量低，青饲时鲜嫩多汁，干草柔软，是良好的饲草原料［12］；另外，野大豆耐盐碱能力突出，筛选耐盐碱的野大豆种质材料进行饲草品种培育或与大豆杂交培育各种耐盐种质材料在盐碱地上应用，是践行“以种适地”盐碱地综合利用的有效途径。

目前，通过航天诱变方式育成的大豆品种已有报道，并指出品质育种应在SP1代开始选择，产量和高光效育种则分别从SP2和SP3代开始选择为宜［13］，但尚未见关于野大豆航天诱变材料的相关报道。逆境条件对作物的品质和产量均会产生影响，因此本研究以黄河三角洲地区野大豆为材料，对航天诱变SP1群体苗期进行盐胁迫处理，通过多指标综合分析、主成分分析、隶属函数综合评价等多元统计方法，建立系统的野大豆种质资源耐盐评价体系，从SP1代开始进行野大豆耐盐突变材料的鉴定，为优异资源发掘交换、耐盐机理解析、航天诱变群体耐逆筛选时期以及品种选育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验野大豆材料取自东营黄三角农高区野外（37°17' N，118°37' E），经单粒传法［14］获得遗传背景相对一致的繁育材料于实验室内长期保存。浓硫酸处理脱泥膜后，野大豆种子经神舟十二号载人飞船于2021 年6-9 月搭载3 个月后返回地面，获得野大豆SP1群体。

1.2 试验设计

于2022 年3 月在中国农业科学院烟草研究所植物培养间内开展试验。挑选籽粒大小基本一致的150 粒种子，播种于装满蛭石的32 孔育苗盘中（规格540 mm×280 mm×53 mm），每个穴孔播种1 粒，播种深度1 cm。从育苗盘底部倒入2 L 1/10 MS 营养液，在光周期为16 h 光照，8 h 黑暗，温度（24±1） ℃，湿度60%的植物培养间进行培养。待80%植株子叶完全展开时，从育苗盘底部加入3 L 150 mmol·L-1NaCl 溶液，使蛭石中盐溶液处于饱和状态。蛭石缺水时，均从育苗盘底部加入过量的150 mmol·L-1NaCl 溶液，以充分淋洗蛭石中的盐分，使盐溶液浓度维持稳定。试验过程中NaCl 溶液均使用1/10 MS 营养液配置。

1.3 调查指标

盐胁迫7 d 后，剔除SP1群体中包括子叶不伸展、无生长点以及植株明显矮化不再生长的各种突变类型，调查植株株高（7 d plant height， 7PH）、下胚轴长（7 d hypocotyl length， 7HL）和下胚轴粗（7 d hypocotyl diameter，7HD，子叶处）；盐胁迫21 d 后调查植株株高（21 d plant height， 21PH）、下胚轴长（21 d hypocotyl length， 21HL）、茎粗（21 d stem diameter， 21DD，子叶处）、叶绿素a 含量（content of chlorophyll a， CCA）、叶绿素b 含量（content of chlorophyll b， CCB）、叶面积（leaf area， LA）、单叶鲜重（fresh weight of leaf， FWL）和单叶干重（dry weight of leaf， DWL）等11 个指标。其中叶面积、单叶鲜重和单叶干重调查植株的第一对真叶平均值，真叶使用Canon 5D Mark III（日本）拍照后，用Image J 软件（https：//imagej. net/software/fiji/，Fiji 版）进行面积测量；叶片干鲜重使用万分之一电子天平称重。叶绿素a 和叶绿素b 使用植株的第2～4 片真叶包括复叶进行测量，植株生理指标丙二醛（malondialdehyde， MDA）、过氧化物酶（peroxidase， POD）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）和过氧化氢酶（catalase， CAT）的含量使用植株剩余叶片测量。上述指标的测定方法按照薛秀栋等［15］的报道进行，其中叶绿素含量测定使用分光光度计法，MDA 含量测定使用硫代巴比妥比色法，POD 活性测定使用愈创木酚法，SOD 活性测定使用氮蓝四唑法，CAT 活性测定使用紫外吸收法。

1.4 数据分析

使用Microsoft Excel、SPSS 24.0 等软件进行平均值、极值、方差、显著性分析、相关性分析、主成分分析以及聚类分析等多元分析内容。用到的相关公式如下：

式中：U表示隶属函数值，Xij表示第i个种质的第j个主成分分值，Xjmax表示第j个主成分的最大值，Xjmin表示第j个主成分的最小值。

式中：权重wj表示第j个主成分的重要程度，pj表示第j个主成分的贡献率。

式中：D值表示第i个诱变材料在盐胁迫条件下的耐盐性综合评价值，根据D值将突变体材料划分为4 个耐盐等级：0.75≤D≤1.0，高耐盐；0.50≤D＜0.75，耐盐；0.25≤D＜0.50，中间型；0≤D＜0.25，不耐盐。最后，根据D值采用欧式距离，最短距离法对129 个SP1个体进行聚类。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫下野大豆SP1群体苗期各性状变异分析

苗期11 个性状的调查结果如表1 所示，各个指标的变异系数为6.45%～51.78%。在11 个指标中，以21 d 株高、7 d 株高和叶面积3 个指标的变异系数较大，分别为51.78%，24.96%和24.03%，说明其对盐胁迫的响应较为灵敏；叶绿素a（6.45%），7 d 下胚轴粗（11.09%）和叶绿素b（11.20%）这3 个指标的变异系数相对较小，说明盐胁迫对这些指标的影响较小。

表1 野大豆SP1群体盐胁迫下各性状变异统计Table 1 Variation analysis of characters in SP1 population of wild soybean under salt stress

2.2 指标相关性分析

对11 个盐胁迫下性状进行相关性分析，结果如表2 所示，7 d 株高与21 d 株高、单叶鲜重和单叶干重呈显著正相关，与7 d 下胚轴长和叶面积呈极显著正相关；7 d 下胚轴长与21 d 下胚轴长呈显著正相关，与7 d 下胚轴粗呈显著负相关，与单叶鲜重和单叶干重呈极显著正相关；7 d 下胚轴粗与21 d 茎粗呈极显著正相关，但与21 d 株高呈极显著负相关；21 d 株高与21 d 下胚轴长和单叶鲜重呈显著正相关，与叶绿素b 呈极显著正相关，但与21 d 茎粗呈极显著负相关；21 d 下胚轴长与叶面积呈极显著正相关，与21 d 茎粗呈显著负相关；21 d 茎粗与叶绿素b 呈显著正相关，与单叶鲜重和单叶干重呈极显著负相关；叶绿素a 与单叶鲜重呈极显著正相关；叶面积与单叶鲜重和单叶干重呈极显著正相关；单叶鲜重与单叶干重呈极显著正相关。

表2 野大豆SP1群体盐胁迫下各个指标相关性分析Table 2 Correlation analysis of each index in SP1 population of wild soybean under salt stress

2.3 主成分分析

对在150 mmol·L-1浓度盐胁迫下的11 个调查指标进行主成分分析。根据特征值大于1 和累计贡献率大于90%的原则，共提取到5 个主成分，各成分的贡献率分别为36.49%、15.56%、12.36%、16.67%和10.64%，累计贡献率达到91.72%，可代表11 个单一指标的绝大部分信息。各主成分因子的特征值，对原始指标的载荷矩阵和对表型的贡献率如表3 所示。主成分因子I 主要与7 d 下胚轴长、21 d 株高和21 d 茎粗等性状密切相关；主成分因子II 主要与叶绿素b、叶面积和单叶鲜重等密切相关；主成分因子III 主要对7 d 下胚轴粗、21 d 茎粗和叶绿素a 等性状发挥作用；主成分因子IV 主要与7 d 株高、7 d 下胚轴长和21 d 下胚轴长等性状密切相关；而主成分因子V 主要与叶绿素b、单叶鲜重和单叶干重等性状密切相关。综上，通过主成分分析将盐胁迫下野大豆SP1群体的11 个耐盐相关指标转换为了5 个独立的综合指标，以用于下一步的耐盐综合评价分析。

表3 前5 个主成分的特征值及特征向量描述Table 3 Eigen values and eigenvectors of the first five principal components

2.4 耐盐性综合评价

根据不同SP1个体野大豆的主成分值，利用公式1）计算5 个综合指标的隶属函数值，利用公式2）计算各主成分的权重，5 个主成分的权重值分别为0.3978，0.1697，0.1347，0.1817 和0.1160。得到综合指标的隶属函数值和各自权重后，根据公式3）进一步计算各SP1群体个体的耐盐性综合评价指标D值。各材料D值范围为0.1890～0.8981，综合评价D值越高代表材料的耐盐能力越强，根据评判标准，共鉴定到高耐盐材料10 份（0.7582≤D≤0.8981），耐盐材料53 份（0.5031≤D≤0.7451），中间型材料63 份（0.2505≤D≤0.4901）以及3 份不耐盐材料（0.1890≤D≤0.2340）（表4）。

2.5 聚类分析

利用不同野大豆突变株系耐盐性评价值D值，根据最短距离法对129 份野大豆突变株系进行聚类。如图1 所示，所有供试材料被划分成了4 类，各亚类较好地对应了野大豆突变株系耐盐（含高耐盐）、中间型和不耐盐4 个耐盐级别。第I 类包含32 份材料，D值为0.5093～0.8930，其中包含8 份高耐盐材料和24 份耐盐材料；第IV 类包含31 份材料，D值为0.3633～0.8981，其中包含2 份高耐盐材料，2 份中间型材料和27 份耐盐材料；第III 类包括62份材料，D值为0.2505～0.6373，包含60 份耐盐性中等的中间型材料和2 份耐盐材料；第II 类包含4 份材料，D值为0.1890～0.3410，是SP1群体中相对最不耐盐的材料，包括不耐盐材料3 份和中间型材料1 份。

图1 129 份野大豆材料D 值聚类分析Fig.1 D-value cluster of 129 wild soybean materials

2.6 生理指标测定

从不同耐盐等级材料中各随机挑选1 份，测定盐胁迫下叶子MDA 含量和抗氧化酶活性（图2）。除POD 活性为高耐盐材料（SP1-29）显著高于不耐盐材料（SP1-40）外（图2D），MDA 含量、SOD 和CAT 活性在四类耐盐性不同的野大豆突变材料中差异不显著（图2A～C），这说明POD 在野大豆航天诱变材料的耐盐性中发挥重要作用。

图2 代表性诱变个体生理指标测定Fig.2 Physiological indexes of representative mutagenic individuals

3 讨论

“以种适地”提高盐碱地产能和利用效率，是综合利用盐碱地的有效手段，而获得良好的耐盐植物品种是实现这一目标的前提。航天诱变是一种特殊的物理诱变方式，通过后期持续选育不仅能够有效获得性状稳定的遗传材料，而且还能大幅缩短育种时间［4］。与其他理化诱变类似，诱变方式造成的非致死性遗传损伤一般都会遗传给下一代，并且在自交繁殖的过程中逐渐纯合。因此航天诱变材料在SP1当代就能够表现出农艺性状差异［16］。王瑞珍等［17］研究指出，大豆SP1群体的发芽率、熟期、株高、单株总荚数等性状指标与未经搭载的大豆相比都发生了显著变化。本研究统计了盐胁迫下野大豆SP1群体苗期的11 个指标，变异系数为6.45%～51.78%，以株高和叶面积为主的农艺性状变异系数较大（表1），这说明野大豆SP1群体的确表现出了性状变异，与前人研究一致。

一般而言，SP2～SP4世代是航天诱变材料后代分离和性状筛选的主要世代。棉花（Gossypiumspp.）SP3世代纤维品质变异程度大且范围广，筛选出的突变体一般都有比较好的产量性状［18］。大豆SP2代对光合相关性状如净光合速率等选择效率较低，但在SP3和SP4代进行筛选效果则很好［19］。单株有效荚数、底荚高度、单株粒数以及节间长度等性状在SP2代筛选效果较好，但是对株高和有效节数的筛选作用较差［20］。总的来说，大豆航天品质育种应在SP1代开始选择，产量性状从SP2代开始选择为宜，而高光效品种的选择则从SP3代开始效率较高［13］。虽未见从低代开始进行耐盐植株筛选的报道，但是对野大豆航天突变材料开展耐盐评价和耐盐株系筛选，对后期在高世代诱变群体中进行耐盐材料的筛选具有指导意义。

国内外相关学者在作物耐盐评价和筛选方面开展了大量卓有成效的工作，普遍认为盐胁迫在作物的不同生育时期危害性不同，苗期对盐胁迫尤为敏感［21］。目前对野大豆耐盐性的研究多集中在芽期，以适应NaCl 单盐或者复合盐溶液浓度为主要方向［22-24］，也有开展盐胁迫对野大豆苗期单一生理性状指标如光合相关指标［25］、抗氧化酶活性［23］以及钠钾含量和盐诱导基因表达等影响的相关研究［26］，但是关于野大豆苗期耐盐性综合评价方法和耐盐品系筛选的研究较少［27］。在本研究中，采用主成分分析方法降低测定指标维度，将多个相互关联的指标转化为少数几个相互独立且能最大程度上反映样本特征的指标，通过主成分隶属函数和贡献率计算每一个株系的耐盐综合评价指标D值，建立起的综合评价体系将对后续野大豆耐盐评价起到指导作用。

丙二醛（MDA）是植物细胞膜脂过氧化的主要产物之一，通常用来作为评价脂质过氧化程度的指标［15］。盐胁迫等逆境胁迫通常会造成植物膜系统损伤，因而MDA 含量也通常用作表示植物遭受逆境损伤的指标。在使用不同浓度NaCl 溶液处理多个野大豆种质材料时，MDA 含量随盐浓度的升高逐渐增加［23］，表明MDA 是野大豆盐胁迫响应的一个指示因子。在野大豆SP1群体中，不耐盐的突变材料MDA 含量虽与耐盐材料相比无统计学意义上的显著差异，但是含量也高于多个耐盐突变材料（图2A），这与赵如皓等［25］的研究结果基本一致。另外，抗氧化酶也是植物抵御盐胁迫的一个重要途径。在SOD、CAT 和POD 等抗氧化酶的作用下，由盐胁迫导致的超氧阴离子被逐渐分解成水和氧气［28］。在本研究中，鉴定到的不同耐盐分级的野大豆突变材料，其SOD 和CAT 活性在盐胁迫下没有显著差异（图2B 和C），但是POD 活性在不耐盐的株系中较高耐盐材料显著降低（图2D）。而在其他区域的耐盐野大豆种质材料中也有类似的现象，即抗盐能力较强的种质其POD 活性也高［23］，这说明POD 很可能是野大豆响应盐胁迫的重要途径。

4 结论

盐胁迫下野大豆SP1群体农艺性状变异丰富，株高性状变异系数最大。检测的11 个性状指标归为5 个主成分，通过对主成分进行隶属函数和权重分析，构建了基于D值的野大豆SP1群体耐盐综合评价指标和体系，共筛选出高耐盐材料10 份，耐盐材料53 份，中间型材料63 份以及3 份不耐盐材料。生理指标测定表明POD 在野大豆耐盐过程中发挥重要作用。