不同产地半夏指纹图谱的建立及化学模式识别研究*

魏淑婕，张蒙蒙，贾晓华，欧阳慧子，李天祥，何俊

（1.天津中医药大学，组分中药国家重点实验室，天津 301617；2.天津中医药大学第一附属医院，天津 300381）

半夏来源于天南星科多年生草本植物半夏Pinelliaternata（Thunb.）Breit.的干燥块茎，辛、温，有毒，归脾、胃、肺经[1]，具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结等功效[2]。半夏作为中药材始见于《五十二病方》，后在《伤寒杂病论》中被广泛使用。目前，因其具有抗肿瘤、降低血脂及抗新型冠状病毒感染等药理作用而备受关注，成为临床常用药材之一[3-4]。随着市场需求量不断增加，而半夏野生资源匮乏，存在市场缺口，人工栽培成为其替代途径，但人工栽培过程中存在栽培技术滞后、品种选育研究薄弱等问题[5]，导致市售半夏质量参差不齐、来源复杂，给临床用药带来诸多不便。如何利用现代分析方法控制半夏质量，是半夏药材研究进展中亟待解决的问题。

中药所含化学成分多样复杂，单一或几个成分不能全面反映药材质量[6]，指纹图谱能够在整体层面表征药材化学成分，是一种综合、可量化的鉴别与评价手段[7-9]。化学模式识别技术可对中药指纹图谱信息进行深度挖掘，反映中药的内在成分差异，对其质量控制具有重要意义[10-12]。因此，本研究采用超高效液相色谱（UPLC）法建立半夏药材指纹图谱，并运用SPSS 和SIMCA 软件进行化学模式识别分析，以期为半夏质量研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1290 UPLC 色谱仪（美国Agilent公司）；Milli-Q IQ 7005 超纯水制备仪（Millipore 公司）；5424R 型高速控温离心机（德国Eppendorf 公司）；AS60/220.R2 型十万分之一天平（波兰Radwag 公司）；G3KT18273 型旋涡混合器（赛默飞世尔科技公司）。

1.2 试药 对照品：胞苷（批号：DST190314-087）、次黄嘌呤（批号：DST190407-087）、尿苷（批号：DST190108-024）、肌苷（批号：DST180521-028）、鸟苷（批号：DST190311-045）、腺苷（批号：2-ALI-112-1）均购自成都曼斯特生物科技有限公司；磷酸（色谱级）购自美国ROE 公司；乙腈（色谱级）购自美国Fisher 公司；超纯水由Milli-Q 超纯水制备仪制备。

1.3 药材 半夏药材采自不同产区，样品去除泥沙与杂质，干燥，粉碎备用。具体样品信息见表1，经天津中医药大学李天祥教授鉴定为天南星科植物半夏Pinelliaternata（Thunb.）Breit.的干燥块茎。

表1 半夏药材样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相：A 相0.1%磷酸水，B 相乙腈；梯度洗脱，洗脱梯度为：0～5 min，1%～5%B；5～9 min，5%～14%B；9～10 min，14%～20%B；10～14 min，20%～45%B；流速：0.2 mL/min；进样体积：10 μL；柱温：32°C；检测波长：260 nm。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取胞苷、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷对照品各5.0 mg，加水溶解，配制成1 mg/mL 的对照品溶液，置于4 ℃冰箱储存备用。

2.3 供试品溶液的制备 精密称取半夏粉末（过4 号筛）1.0 g 置于10 mL 锥形瓶中，加水溶解定容至刻度线处，超声（功率250 W，频率50 kHz）提取30 min后取出，放至室温再次称取质量，补足失去的质量，用0.22 μm 滤膜过滤取续滤液，即得供试品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度实验 取半夏样品（S9）粉末，精密称定1.0 g，按照“2.3”项下的制备方法制备供试品溶液，在“2.1”项的色谱条件下连续进样6 次，计算得到各共有峰保留时间RSD 均小于0.1%，峰面积RSD 小于1.7%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性实验 取半夏样品（S9）粉末，精密称定1.0 g，按照“2.3”项下的制备方法，平行制备6 份供试品溶液，在“2.1”项的色谱条件下进样，计算得到各共有峰保留时间RSD 小于1.5%，峰面积RSD小于5.9%，表明该方法重复性良好。

2.4.3 稳定性实验 取半夏样品（S9）粉末，精密称定1.0 g，按照“2.3”项下的制备方法制备供试品溶液，并在“2.1”项的色谱条件下分别于0、2、6、8、12、24 h 进样分析，计算得到各共有峰保留时间RSD 小于0.6%，峰面积RSD 小于6.6%，表明样品在24 h内稳定性良好。

2.5 指纹图谱的建立 分别称定18 批半夏样品各1.0 g，按照“2.3”项下的制备方法制备供试品溶液，并在“2.1”项的色谱条件下进样分析，得到UPLC 指纹图谱。将色谱图数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.130723 版本）”，生成18 批供试品色谱图，其中共标定15 个共有峰，通过对照品比对指认出6 个色谱峰，分别为胞苷（3 号峰）、次黄嘌呤（4 号峰）、尿苷（6 号峰）、肌苷（7 号峰）、鸟苷（10 号峰）、腺苷（12 号峰），供试品色谱图及混合对照品图谱见图1。

图1 供试品及混合对照品指纹图谱

2.6 相似度评价 设置S1 为参照图谱，采用平均数法，时间窗宽度为0.1，通过多点校正后进行整体相似度评价，相似度评价结果见表2。16 批不同产地半夏药材相似度均大于0.877，其余2 批样品指纹图谱与对照图谱相比相似度较低，其中S12（山西省运城市新绛县）相似度为0.606，S16（河北省石家庄市鹿泉区）相似度为0.778。结果表明，大部分产地半夏样品指纹图谱的一致性较高，只有2 批样品差异较大。

表2 18 批半夏样品相似度评价结果

2.7 化学模式识别分析

2.7.1 聚类分析 以18 批不同产地半夏药材的15 个共有峰面积为原始数据，经标准化处理后，导入SPSS 23.0 软件，进行聚类分析。以平方欧式距离为测度，采用组间连接法，结果见图2。当类间距离为10 时，18 批样品被分为两组，其中S1～S11、S13～S15、S18 聚为一类，S12、S16 聚为一类。

图2 18 批半夏样品的聚类分析树状图

2.7.2 主成分分析 将18 批半夏药材的UPLC 指纹图谱在260 nm 波长下的15 个共有峰峰面积进行标准化处理后，导入SIMCA 14.1 软件，构建18×15 的原始数据矩阵，Par 作为标度化方式，进行主成分分析。从15 个变量中提取出3 个变量，累计方差贡献率为82.57%，表明该模型的预测能力良好[13]，提取前3 个主成分绘制PCA 得分图，结果见图3。由图3 可知，S1～S11、S13～S15、S18 聚为一类，S12、S16 聚为一类，与聚类分析结果一致。

图3 18 批半夏样品主成分分析得分图

主成分分析载荷图中的点代表各共有峰，距离原点（0，0）越远，表明其权重越大，对样品质量差异影响越大[14]，见图4。由图4 可知，3 号峰（胞苷）、4 号峰（次黄嘌呤）、5 号峰、8 号峰、10 号峰（鸟苷）、12 号峰（腺苷）、13 号峰和15 号峰是不同批次产生差异的主要原因，表明造成S12、S16 与其他批次产生差异是上述多种成分协同作用的结果。

图4 18 批半夏样品主成分分析载荷图

2.7.3 正交偏最小二乘法-判别分析 为了进一步分析不同批次半夏样品的批间差异性，采用SIMCA 14.1 软件在聚类分析和主成分分析的基础上对数据进行正交偏最小二乘-判别分析。正交偏最小二乘-判别分析得分见图5，结果可见18 批样品被较好地分为两类。在建立的分析模型中，结实率参数R2X为0.691，区分参数R2Y为0.927，预测参数Q2为0.789，均大于0.5，说明模型稳定性和预测准确性良好[15]。

图5 18 批半夏样品正交偏最小二乘-判别分析得分图

随机改变分布变量Y的排列顺序200 次进行置换检验，得到置换检验图6，R2回归线在Y 轴截距为0.217，Q2回归线在Y 轴截距为-0.553，说明所建立的模型不存在过拟合现象，可用于判别分析18 批样品的批间差异[16]。

图6 正交偏最小二乘-判别分析模型的置换检验结果（n＝200）

正交偏最小二乘-判别分析模型中变量重要性投影值（VIP 值）可直观反映出各变量对样品分类的贡献值，筛选VIP 值＞1.0 的变量为差异性标志成分[17]，结果见图7。通过对照品指认，具有统计学意义的6 个差异性标志成分的贡献程度依次为3 号峰（胞苷）＞5 号峰＞4 号峰（次黄嘌呤）＞15 号峰＞10 号峰（鸟苷）＞8 号峰，上述成分是S12、S16 样品与其他批次样品之间产生差异的主要原因。在S12、S16 样品中，3 号峰、4 号峰、5 号峰和15 号峰的峰面积均大于其他批次样品，而10 号峰的峰面积均小于其他批次样品。该结果与主成分分析中载荷图的分析结果基本一致。

图7 18 批半夏样品正交偏最小二乘-判别分析各成分VIP 图（±s）

3 讨论

本研究考察了不同提取溶剂（水、70%甲醇、30%甲醇）、色谱柱类型（CORTECS C18柱、ACQUITY UPLC HSS T3 柱）、流动相种类（乙腈-0.1%磷酸水、甲醇-水、乙腈-水）及不同检测波长（210、254、260 nm）条件下样品分析时间、色谱峰峰形、峰数及峰响应的情况，确定采用ACQUITY UPLC HSS T3 柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），以乙腈-0.1%磷酸水为流动相，在260 nm 检测波长下进行分析，所得色谱峰峰形良好，分析时间短。构建了半夏药材UPLC 指纹图谱，并对18 批不同产地样品进行分析。共标定15 个共有峰，其中指认6 个色谱峰，分别为胞苷、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷及腺苷。相似度结果显示16 批样品相似度均大于0.877，其余2 批分别为0.606、0.778。

聚类分析和主成分分析结果一致，大部分批次的样品具有较高一致性，只有2 批样品与其他样品的差异较大。通过正交偏最小二乘-判别分析模型中的VIP 值共筛选出6 个差异性标志成分（经对照品比对指认出其中3 种成分为胞苷、次黄嘌呤、鸟苷），是造成S12（山西省运城市新绛县）、S16（河北省石家庄市鹿泉区）与其他批次产生差异的主要原因。胞苷、次黄嘌呤、鸟苷所属的核苷类成分作为半夏中主要的一类成分，已被证实是半夏“降逆止呕”的主要物质基础[18]。现代研究表明核苷类成分参与DNA 代谢过程，具有抗病毒、抗肿瘤等多种生物活性[19]。陈卫等[20]在不同炮制方法对半夏的差异性影响研究中发现，胸苷、次黄嘌呤和尿嘧啶的含量差异较为显著，可作为半夏不同炮制品有效区分的特征成分。王翠翠等[18]在对半夏及其混伪品的研究中发现，依据尿苷、腺嘌呤、鸟苷和腺苷4 种核苷的含量可以很好地区分半夏、水半夏和虎掌南星。此外，徐文英[19]对比了不同品种半夏中鸟苷和腺苷的含量，发现在不同品种半夏样品中两种成分的含量存在明显差异，认为核苷类成分对于评价半夏质量具有重要意义。本研究结果与上述研究结果较为一致，胞苷、次黄嘌呤、鸟苷的含量可以反映出不同产地半夏样品的差异性，且其所属的核苷类成分为半夏的主要药效物质，因此在对半夏的质量研究中应重点关注胞苷、次黄嘌呤、鸟苷等成分的含量变化。

本研究建立了半夏药材的UPLC 指纹图谱，结合聚类分析、主成分分析等化学模式识别方法进行综合分析，并采用正交偏最小二乘-判别分析筛选出不同产地半夏的差异性标志成分，可为半夏质量评价研究和资源开发利用提供参考。