气道高反应性疾病动物模型研究进展*

张雯婧，代向东，刘帅，张晗，2，李霖，2

（1.天津中医药大学中医药研究院，天津 301617；2.组分中药国家重点实验室，天津 301617）

气道高反应性（AHR）是指机体对非特异性刺激（物理、化学或药物）表现出过度的支气管收缩，从而导致气道狭窄和气道阻力增加的一种病理特征[1]。近年来，国内外众多学者对AHR 的相关机制进行了研究，发现其影响因素主要包括气道变应性炎症、气道重塑、黏液分泌过度与机体免疫反应失衡等[2-3]，见图1。AHR 是支气管哮喘的主要特征之一，乙酰甲胆碱支气管激发试验（MBPT）作为检测和量化AHR 的主要方法，在支气管哮喘的临床诊断中具有重要意义[4]。除此之外，慢性阻塞性肺疾病（COPD）、胃食管反流病（GERD）、新型冠状病毒感染等疾病亦可见AHR 现象，导致MBPT 阳性[5]。以往对AHR 的研究多采用哮喘动物模型，模型较为单一且不具有特异性。建立不同的AHR 疾病动物模型，有利于深入研究AHR 的发病机制，为临床诊治AHR 的药物研发提供实验依据。因此，本文论述了AHR 的常用检测指标，并总结了近年来支气管哮喘、COPD、GRED、新型冠状病毒感染4 种疾病的造模方法及模型评价方法，为AHR 疾病的研究提供一定参考。

图1 AHR 发生机制

1 AHR 检测指标

肺功能检测是目前AHR 测定最普遍的方法。通过给予从低至高浓度的实验动物支气管激发药物乙酰甲胆碱（mACh），检测动物的各项肺功能指标，来反映AHR[6]。以下论述了体外非侵入性检测及体内侵入性检测两种方法。

1.1 体外非侵入性检测 全身体积描记法（WBP）是将动物置于密闭体描箱内，体描箱与通向体描箱外的感应器连接。动物呼吸时，其胸廓的起伏使体描箱内容积发生改变，经计算机处理后，可计算出呼吸间歇（Penh）、吸气时间（Ti）、呼气时间（Te）、潮气量（TV）、呼气中期流速（EF50）等相关参数。其中，Penh 为非侵入性指标，与胸膜内压有较好的相关性，能够很好地反映支气管收缩剂对下呼吸道的刺激作用，目前己被广泛应用[7]。该法可以对清醒自由活动的小动物进行肺功能及气道反应相关的测试，避免创伤性气管切开术及麻醉，可长时间重复进行肺功能检测。

1.2 体内侵入性检测 体内侵入性检测指实验过程中动物需要中度麻醉并进行气管插管，一般行机械通气，控制潮气量（Vt）和呼吸频率，多使用全面的有创动物肺功能测量系统[8]。此方法可获得的参数有：总肺容量（TLC）、功能残留容量（FRC）、呼吸阻力（Rrs）、肺阻力（RL）、呼气气道阻力（Re）、最大呼气中期流速（MMF）、呼气峰流速（PEF）、动态肺顺应性（Cdyn）、用力呼气量（FEV）。其中，RL 和Cdyn是AHR 的经典检测指标，且能够反映肺部的力学变化。该方法实验动物需要麻醉和气管插管，技术和时间要求较高，并且不能重复检测以及动态观察AHR 变化[9-10]。

2 AHR 疾病动物模型

2.1 支气管哮喘动物模型 哮喘是一种由多因素引发的慢性气道炎症性疾病，伴有不同程度的AHR和气流阻塞[11]。研究表明，针对AHR 治疗可以更有效地控制哮喘，同时减轻慢性气道炎症[12]。

支气管哮喘最常用的动物模型为卵清蛋白（OVA）-氢氧化铝（ALUM）诱导模型。模型建立分为致敏阶段和激发阶段，第一阶段给予小鼠腹腔或皮下注射OVA-ALUM 溶液进行致敏，激发阶段通常采用OVA 溶液滴鼻或OVA 溶液雾化激发。OVA 是诱导哮喘的经典抗原，易使实验动物产生AHR 和肺部炎性细胞浸润[13]。Xiao 等[14]于实验第1、7、14 天对小鼠腹腔注射混悬液（含100 μg OVA 与10 mg ALUM）进行致敏，于第21～29 天使用200 μg OVA连续滴鼻诱发支气管哮喘。造模完成24 h 后，麻醉小鼠并进行气管插管，使用不同浓度（0、6、12、24、48 mg/mL）的mACh 连续雾化6 min，每分钟收集1 次气道阻力（Rrs）。结果显示每个浓度的mACh 较基线的Rrs 百分比增加，即模型组小鼠在所有浓度条件下都因吸入mACh 而表现出更高的Rrs。同时，模型组表现出明显的肺部炎性浸润，肺泡灌洗液中总细胞和嗜酸性粒细胞数量显著增加，白细胞介素（IL）-4、IL-5 和IL-13 mRNA 表达水平升高。金光玉等[15]在实验的第7、14、21 天对小鼠皮下注射致敏液（0.1 mg/L OVA），于第31、33、35 天使小鼠雾化吸入OVA 溶液（0.4 mg/L）激发支气管哮喘，第38 天开始，每周2 次、连续12 周继续对小鼠进行雾化吸入。造模完成24 h 后将小鼠麻醉，按浓度倍增法依次静脉注射mACh（2.5、5、10、25、50 mg/mL），随着mACh 浓度的成倍递增，模型组与对照组的RL 均增加，当浓度到达10 mg/mL 以上时，模型组与对照组比较有统计学差异。模型组肺泡灌洗液和肺组织中IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、转化生长因子-β1（TGF-β1）含量和蛋白表达明显升高，Thl/Th2 平衡失调。

以上研究表明，OVA 溶液滴鼻激发或雾化激发，均可导致小鼠出现AHR。针对雾化和滴鼻激发两种方法，Kim 等[16]比较了雾化吸入和鼻内过敏原刺激对AHR 的影响。研究者记录了基线和10 s 后暴露于不断增加的甲基胆碱浓度的Rrs 和呼气值（E 值），两种激发方法的Rrs 值在12.5、25、50 mg/mL的甲基胆碱处理下显著增加。在50 mg/mL 乙酰胆碱暴露条件下，雾化组的Rrs 值高于滴鼻组。与吸入生理盐水对照组相比，吸入12.5、50 mg/mL 乙酰胆碱组E 值显著升高。结果表明，雾化激发法比滴鼻法诱导的AHR 反应更强烈。

2.2 COPD 动物模型 COPD 是一种与吸烟相关的慢性肺部疾病，其典型特征是慢性肺部炎症、气道重塑、肺气肿[17]。目前，约2/3 的COPD 患者存在AHR，其气道反应性介于支气管哮喘与正常人之间[18]。

COPD 常用动物模型有香烟烟雾（CS）诱导模型和香烟烟雾联合脂多糖（CS-LPS）诱导模型。CS 已被证明是COPD 发病的危险因素，同样也是研究中最常见的COPD 动物模型诱导因子[19]。脂多糖（LPS）属于内毒素，进入肺部时可刺激单核细胞、内皮细胞合成并释放一系列炎性介质，使动物的肺部及其气道出现炎症。刘雪君等[20]将小鼠于香烟烟雾中暴露24 周，每周5 d，于第1、15 天经鼻滴入LPS（150 μg/mL）。造模完成后使用WBP 系统检测各组小鼠肺功能。结果显示，与对照组比较，模型组小鼠的FEV0.1/用力肺活量（FVC）、PEF、MMF 和Cdyn 均显著降低，Re 升高，提示小鼠出现AHR。模型组气道周围胶原蛋白沉积增加，血清及肺组织中的IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达水平升高。Liu等[21]选用单纯CS 诱导COPD 模型，每天2 次将小鼠全身暴露于CS 中，持续24 周。使用WBP 检测小鼠肺功能，发现接触CS 小鼠的Penh 显著升高。苏木精-伊红（HE）染色结果显示模型组平均线性截距增加，表明小鼠出现AHR 伴有肺气肿。

为了评估单纯CS 诱导与CS-LPS 诱导对AHR严重程度的影响，有研究者对这两种方式进行了差异比较研究[22]。结果表明，CS 和CS-LPS 组的TLC、FRC 和吸气阻力（RI）均高于对照组，而这两组的FEV50/FVC 较低。此外，LPS-CS 组的RI 和FEV50/FVC 高于CS 组。肺组织的HE 染色结果表明，与对照组相比，CS 组和LPS-CS 组的平均肺泡截获量和小气道壁厚度更高，但与CS 组相比，LPS-CS 组的支气管炎症面积更大。

仅通过CS 暴露建立的COPD 小鼠模型能够更好地模仿人类COPD 在稳定期的基本特征。CS-LPS的联合暴露建立COPD 模型可以更好地模拟人类COPD 在急性加重期的病理特征，AHR 相关指标更为严重。

2.3 GRED 动物模型 GERD 是临床常见病，指胃或者十二指肠内的物质倒流，食管腔因过度接触胃液而引起食管黏膜损伤[23]。胃酸是引起GERD 食管损伤的重要原因，反流进入气管可直接刺激呼吸道黏膜，严重者可导致AHR 甚至哮喘[24-25]。研究证明，在小鼠模型气道内应用酸性物质会导致中性粒细胞气道炎症并增加AHR[26]。

GERD 动物造模方法主要分为3 类：食管内灌注外源性酸法、手术法、微创法。食管内灌注外源性酸法是指食管直接灌注外源性的酸和胃蛋白酶，通过化学刺激损伤食管黏膜，建立GERD 动物模型。研究表明，在使FEV1下降同样标准的情况下，灌注生理盐水组的乙酰胆碱浓度明显高于盐酸灌注组[27]。杨霞等[28]使用盐酸溶液（0.1 mol/L，含0.5%胃蛋白酶）缓慢灌注豚鼠食管下端，持续20 min，每日1 次，连续14 d，建立GRED 模型，通过检测不同浓度mACh 对豚鼠RL 和Cydn 的变化来评估气道反应性。结果表明，mACh 刺激浓度达到0.25 mmol/L和0.5 mmol/L 时，模型组肺阻力增加百分比和肺顺应性减少百分比大于对照组，气道反应性增高，差异具有统计学意义。模型组远端食管黏膜出现溃疡糜烂，炎症表现明显，气管组织和肺组织炎症明显。Cheng 等[29]等研究表明，盐酸灌注导致豚鼠对mACh的反应性增高，当mACh 浓度为60～80 μg/kg 时，模型组气道对mACh 的反应性明显高于对照组。过碘酸雪夫氏（PAS）染色及Masson 染色结果显示盐酸输注导致杯状细胞增生、胶原沉积增加。

目前，很少有研究者使用手术法和微创法来研究AHR 的变化，手术法和微创法是否能够导致AHR 有待研究。食管内灌注外源性酸法操作流程相对简单，易产生AHR，有助于食管黏膜损害和防御机制的研究，适用于病理及病因学研究，并可用于评价药物治疗效果，是研究GERD 疾病中AHR 现象的较好选择。但由于人体内反流物成分复杂，而实验灌注成分相对单一，无法精确模拟GERD 生理病理过程且不适于远期临床研究。

2.4 新型冠状病毒感染动物模型 新型冠状病毒属于冠状病毒科有包膜的正链单链RNA 病毒，其包膜上的刺突蛋白（S 蛋白）能与细胞表面特异性受体血管紧张素转化酶2（ACE2）结合[30]。新型冠状病毒感染可导致毛细血管通透性增高，影响通气功能，严重者会导致AHR 甚至急性呼吸衰竭[31-33]。

目前，通过靶向ACE2 建立了多种新型冠状病毒感染动物模型。在此分为转基因动物模型及非转基因动物模型。啮齿类（小鼠、大鼠）动物由于ACE2在353 位含有组氨酸，不能作为新型冠状病毒的有效受体[34]，人源ACE2（hACE2）转基因小鼠“应时而生”。表达hACE2 的转基因小鼠对新型冠状病毒非常敏感，鼻腔或胃内接种新型冠状病毒毒株后，在其肺部、气管和脑组织中都可以看到强大的病毒RNA 复制。免疫染色表明，在神经元、星形胶质细胞和微胶质细胞中也可以检测到病毒S 蛋白表达[35]。非转基因动物模型指灵长类（恒河猴）和其他哺乳动物（雪貂、猫、犬）ACE2 能与新型冠状病毒S 蛋白紧密结合。此类模型感染病毒后出现体温升高、体质量减轻的现象，病毒于动物的呼吸道高效复制，引起了肺部病变。该模型克服了转基因小鼠制作过程中建模时间长、操作难度大等困难[36]。

以上两种模型均使用新型冠状病毒感染动物，但新型冠状病毒活病毒的分离、培养、动物接种等实验活动均要求在生物安全三级实验室内进行，对实验室要求较高，存在生物安全隐患。近期有研究表明，LPS 雾化吸入诱导的急性肺损伤动物模型可以最大限度表征新型冠状病毒引发的肺损伤[37]。LPS雾化吸入致使小鼠RL 升高，中性粒细胞数量增加，诱发了严重的急性炎症反应[38]。

目前对新型冠状病毒感染动物模型的研究大多止步于评估病毒复制程度、肺部病理，较少研究者使用动物模型评估新型冠状病毒感染的肺功能。临床数据表明，肺功能异常和肺弥漫功能损害在严重的急性新型冠状病毒感染患者中更常见，且此类患者在康复后仍可能存在AHR[39-40]。非转基因动物模型临床表现轻微且肺部病毒滴度相对较低[41]，故此类模型不适用于研究AHR。相对来说，转基因动物模型以及LPS 雾化致急性肺损伤动物模型更适于AHR 的研究。

3 结语

AHR 是支气管哮喘的主要病理生理和诊断指标，是COPD、GRED、新型冠状病毒感染等疾病的临床表现之一[42-44]。AHR 发病机制复杂，与气道炎症、气道重塑和黏液分泌过多有着千丝万缕的联系，但其具体分子机制至今仍不明确。动物模型作为人类疾病研究中不可或缺的工具，为AHR 疾病的发病机制研究提供了实验基础。如上所述，4 种疾病的动物模型可不同程度地再现AHR，总结与归类见表1。由此可见影响AHR 的因素复杂多变，烟雾、粉尘、细菌及病毒刺激均可导致AHR，并与机体免疫息息相关。为了更深入地研究AHR 的发病机制，实验设计者必须要明确各种动物模型的特点，在试剂选择、试剂用量以及造模周期等方面反复推敲，注意在不同疾病动物模型中AHR 检测指标的差异性，结合实际情况遴选恰当的评价指标，以构建与临床AHR 疾病更加吻合的动物模型。

表1 4 种AHR 疾病动物模型总结

值得注意的是，西医AHR 疾病动物模型已较为完备，但中医证候模型较少。AHR 疾病是一种难治性的慢性疾病，单纯西医治疗疗程较长，疾病容易反复发作，中医药在对AHR 疾病的治疗上显示出独特的优势。中医认为AHR 多发作于痰瘀交阻，AHR 状态下，机体为保证一定的肺通气血流比例，使得气管、血管收缩，血液黏滞度增加，血流的壅滞不畅导致渗出增多、炎症反应加剧[45]。现代学者通过动物实验论证了中医方剂、中药提取物对于治疗AHR 的疗效，并且进一步研究了其作用机制，但都采用了西医制作动物模型的方法，在病证结合方面研究较少，目前也尚无统一的标准与规范[46-47]。因此，在已有动物模型的基础上，结合中医特点，复制中医病证结合模型方法及评价是今后AHR 疾病动物模型研究的重要发展方向。