基于网络药理学的海桐皮治疗类风湿关节炎机制研究∗

罗业浩，唐秀松，许栋涵，庞宇舟，李仁锋

1 广西中医药大学/壮医方药基础与应用研究重点实验室，广西 南宁 530200；

2 澳门科技大学中医药学院，澳门特别行政区 999078；

3 广西中医药大学/壮瑶药工程技术研究中心，广西 南宁 530200；

4 广西中医药大学第一附属医院,广西 南宁 530023

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种难治性免疫性疾病，临床主要表现为侵蚀性、对称性多关节炎损害［1-2］。流行病学资料显示，RA的发病率女性和男性分别在70～74 岁和75～79岁年龄组最高，男女比例为1∶4，我国患病率为0.32%～0.36%［3］。RA 发生发展的生物过程复杂，确切的发病机制尚不清楚，认为主要与遗传因素、生活环境、细菌及病毒感染有关［4］。西医针对RA的治疗主要包括非甾体类抗炎药、生物制剂及糖皮质激素等。中医近年来在RA 的治疗中发挥了重要作用，中医认为RA 属“痹症”范畴，其主要病机是“外邪侵袭肢体，经络闭阻，不通则痛”，治疗以“驱邪通络”为主［5］，多使用具有祛风除湿功效的药物，这些药物对缓解患者疼痛、改善患者生活质量、延缓病情进展等有重要作用，但具体作用机制尚不明确，而网络药理学为分析药物与疾病关联性的有效工具，故本研究应用网络药理学方法探索药物与疾病之间的相互作用机制，有助于更好地了解药物发挥治疗作用的机理。

海桐皮Aralia chinensisL.又名鹊不踏、鸟不宿等，为豆科植物刺桐的干皮，为常用的中草药，性温，味微咸，入肝、心、肾3 经，具有镇痛消炎、祛风行气、祛湿活血之效，是治疗风湿痹痛的关键药物之一，为临床常用药物［6］。

网络药理学［7-8］是一门新兴学科，其原理是基于系统生物学和生物网络平衡阐释疾病发生发展过程、从改善或恢复生物网络平衡的整体观角度认识药物与机体的相互作用并指导发现新药。本研究基于大数据平台及计算机技术，结合网络药理学原理，探讨海桐皮治疗RA 的可能作用靶点及通路，为中药挖掘提供思路。

1 研究方法

1.1 海桐皮药物有效成分及相关靶点收集以“海桐皮”为关键词在中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform ，TCMSP）（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）中进行检索，按照口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和药物类药性（drug-likeness，DL）≥0.18 进行筛选，最终得到海桐皮的有效成分。导出海桐皮药物相关靶点，最终得到海桐皮相关靶点数据。

1.2 RA 疾病数据收集以“rheumatoid arthritis”为关键词分别在人类基因数据库（the human gene database，GeneCards）、Disgenet 数据库进行查找，物种来源选择“Homo sapiens”，下载保存合并数据后去除重复基因，最终获得RA 的相关疾病基因。

1.3 海桐皮相关靶点基因注释运用Perl脚本，以uniprot 蛋白数据库为参照进行海桐皮药物相关靶点基因注释，得到海桐皮相关药物靶点基因。

1.4 海桐皮- RA 交集基因运用R 软件中的Venn Diagrams 程序包取RA 疾病基因和海桐皮药物相关靶点基因的交集基因，绘制韦恩图。

1.5 药物-疾病作用网络构建将药物-疾病交集基因运用perl脚本进行映射，获得药物-疾病之间相互作用的有效成分及相关基因靶点，随后将所得有效成分及相关基因靶点数据导入Cytoscape 3.7.1 软件进行可视化网络构建，展现药物-有效成分-基因靶点-疾病网络。

1.6 海桐皮- RA 蛋白互作网络构建利用在线String网站（https：//string-db.org/）对药物-疾病交集基因进行药物-疾病之间蛋白相互作用网络构建，筛选标准：检测物种选择人（Homo sapiens），置信值（medium confidence）取0.04，去除网络中离散或无关联的蛋白，最终得出海桐皮-RA 相互作用蛋白网络图。

1.7 基因本体论功能富集分析（gene ontology，GO）和KEGG富集分析（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）利用R 软件中的RSQLite、BiocManager、org.Hs.eg.db程序包处理所得交集基因，获得交集基因的ID，将获得的基因ID 再运用R 软件中的colorspace、stringi、DOSE、clusterProfiler、pathview 程序包进行GO 生物过程富集分析及KEGG通路富集分析。

2 结果

2.1 海桐皮有效成分最终获得海桐皮有效成分6个，见表1。

2.2 海桐皮相关靶点基因注释结果将海桐皮225 个相关靶点以Uniprot 数据库作为筛选库，对海桐皮相关靶点基因进行注释，最终得到46 个药物相关靶点基因，主要包括PTGS1、NOS2、MAPK14、GSK3B、SLC6A3等。

2.3 RA 疾病基因在GeneCards 数据库中找到RA 基因253 个，在Disgenet 数据库找到RA 基因430个，去除重复基因，最后得到RA基因450个，这些基因主要有IL-6、HLA-DRB1、TNF、PTPN22、IL-10、STAT4、MIF、IL-2RA、IRF5、IL-1B、HLA-B等。

2.4 海桐皮药物靶点基因与RA 疾病基因交集结果对“2.2”项所得46 个有关海桐皮药物靶点基因与“2.3”项所得450 个RA 疾病基因运用R×64 3.5.3 软件进行计算分析，结果得到14 个交集基因，分别为ADRA2B、ADRA1B、ADRB2、ADRA1D、NOS2、NR3C2、ADRA2A、SLC6A2、ADRB1、ADRA1A、ADRA2C、SLC6A4、DRD2、PPARG，绘制Venny图，结果见图1。

图1 药物-疾病靶点基因Venny图

2.5 药物-疾病相互作用网络将获得的14 个交集基因运用Perl 脚本处理后导入Cytoscape 3.7.1 软件进行可视化网络构建，展现药物、疾病、基因、分子相互作用网络，见图2。

图2 海桐皮主要活性成分-靶点-药物-疾病网络

2.6 海桐皮-RA蛋白互作网络最终得出的相应PPI网络有13个节点，32条边，平均每个节点的度为4.57，平均局部聚类系数为0.61，PPI enrichmentP＜1.0e-16，见图3。

图3 交集基因PPI网络图

2.7 海桐皮-RA 蛋白互作网络核心蛋白在海桐皮-RA 蛋白相互作用网络中，下载其string_interactions文件，并以tsv格式保存，运用R×64 3.5.3 软件绘制海桐皮在该网络中核心蛋白条形图，结果显示ALB、IL-6、NOS3、VEGFA、FOS 等在该网络中起关键作用，见图4。

图4 PPI网络核心蛋白条形图

2.8 GO与KEGG将所得14个交集基因导入R×64 3.5.3 软件进行GO 生物过程富集分析和KEGG 通路分析，结果显示海桐皮治疗RA 的主要生物过程包括了肾上腺素受体活性、G 蛋白偶联的胺受体活性、儿茶酚胺结合、肾上腺素受体结合等过程，KEGG信号通路富集分析显示主要涉及的信号通路包括了cGMP-PKG信号通路、神经活性配体-受体相互作用信号通路及cAMP等信号通路等。GO分析结果见图5，KEGG通路富集分析见图6—8及表2。

图5 GO富集分析条形图

图6 KEGG富集分析条形图

图7 cGMP-PKG信号通路图

3 讨论

RA 是一种慢性自身免疫性疾病，其特征性表现主要是进行性、对称性、多滑膜关节炎和关节外表现，最终导致关节畸形、功能障碍，严重影响患者生活质量［9］。对于RA 的发病机制，目前研究认为其主要与免疫紊乱、细胞因子网络、遗传因素及环境因素等有关［10-14］。在分子机制方面，认为多种细胞因子如IL-B12、微小RNA（microRNAs，miRNA）、基因多态性及信号传导通路在RA 的滑膜和骨质破坏过程中发挥作用［15-21］。近年来，中医药在治疗RA 中发挥重要作用，中药对降低促炎性细胞因子产生及减轻患者疼痛与炎症反应有重要作用，对RA 具有治疗作用［22-24］。海桐皮是临床常用于治疗风湿痹痛的有效药物，海桐皮中含有刺桐灵碱、氨基酸和有机酸等，由海桐皮组成的海桐皮汤化裁常用于治疗骨关节炎、骨折等，对骨关节修复具有重要作用［25-27］。

本研究通过TCMSP 筛选得到海桐皮有效成分6 个，分别为赤藓碱（Erythraline）、异巴巴胆（isobavachin）、豆甾醇（Stigmasterol）、赤藓碱（Erysotrine）、菜豆蛋白（Phaseolin）、菜豆素（Phaseollidin）。其中赤藓碱（Erythrina）属的第一种化学物质在1930 年被报道，其中分离出类胡萝卜素，一种螺环状生物碱，显示出咖喱样活性［28］，赤藓碱生物碱通过调节烟碱样受体对中枢神经系统产生影响，其在中枢神经系统中具有重要生物活性，其对疼痛、焦虑、失眠有良好调控作用［29-30］，虽然目前未见其治疗RA的报道，但其治疗疼痛的特性可能缓解RA 疼痛。豆甾醇又名豆固醇、甾醇属植物甾醇，具有较强的生理活性和表面活性，可抗炎、抗氧化、抗癌、降胆固醇等［31］，CHEN等［32］研究发现，豆甾醇能抑制基质金属蛋白酶表达，抑制软骨降解。Erysotrine属赤藓碱类，赤藓碱的mulungu 提取物能降低IL-4 和IL-5 水平，提高IL-13和干扰素γ（interferonγ，IFN-γ）水平，表明其对炎症治疗有一定潜在价值。异巴巴胆、菜豆蛋白、菜豆素目前尚未见相关报道，可为进一步研究海桐皮治疗RA提供新方向。

此外，本研究发现了14个海桐皮与RA的交集基因，通过STRING数据库得出海桐皮治疗RA的核心蛋白包括ALB、IL-6、NOS3、VEGFA、FOS、PPARG、NR3C1、CRP 等20 个核心基因，其中ALB 基因编码是人类血液中最丰富的蛋白质。该蛋白在调节血浆胶体渗透压中起作用，并充当多种内源性分子（包括激素、脂肪酸和代谢产物）以及外源性药物的载体蛋白。该蛋白还表现出广泛底物特异性的酯酶样活性。IL-6为在炎症和B细胞成熟中起作用的细胞因子。另外，已证明编码蛋白质是患有自身免疫性疾病或感染者发烧的内源热原，该蛋白主要在急性和慢性炎症部位产生，并通过IL-6受体α诱导转录炎症反应。有研究表明，IL-6 与RA有密切关系，参与了RA 骨破环、炎症反应等［33-34］。一氧化氮合酶3（nitric oxide synthase，NOS3）是一种蛋白质编码基因，在多种过程中充当生物介质，包括神经传递以及抗微生物和抗肿瘤活性。NOS3 基因参与了抑制血管内皮表面血小板和白细胞的黏附、聚集及血管平滑肌细胞增生［35］。同时，本研究发现，肾上腺素受体活性、G 蛋白偶联的胺受体活性、儿茶酚胺结合等均参与了海桐皮治疗RA 的过程，其中肾上腺受体作为联系神经系统与免疫系统的重要受体，可能参与了对RA 的神经免疫调节，介导了RA 的炎症反应过程及细胞凋亡过程［36-38］，G 蛋白偶联的胺受体（G proteincoupled receptors，GPCRs）在免疫应答调节中起重要作用，GPCRs家族包括β2肾上腺素受体、趋化因子受体，其中趋化因子在RA 致炎机制中一方面通过迅速刺激依赖凝集素的T淋巴细胞黏附，趋化特定的细胞到炎症部位，导致免疫细胞穿过血管到达关节，另一方面通过其他生物功能调节因子，包括淋巴细胞活化、分化以及酶和细胞因子的释放、细胞毒作用及其他起作用［39-41］。儿茶酚胺被认为是神经细胞或内分泌细胞分泌的神经递质或激素，有研究表明，RA的炎症机制与免疫细胞中内源性儿茶酚胺的活性增强相关，并通过儿茶酚胺调控促炎性细胞或炎症抑制细胞增殖与功能实现［42］。

cGMP-PKG 信号通路、神经活性配体-受体相互作用、钙信号通路、cAMP 信号通路等同样参与了海桐皮治疗RA等生物过程，其中cGMP-PKG信号通路是指环鸟苷酸/蛋白激酶G 信号通路［43］，其主要功能与平滑肌松弛，抑制非选择性离子通道的Ca2+电导率有关。神经活性配体受体相互作用信号通路是质膜上所有与细胞内外信号通路相关的受体和配体，与环境信息处理、信号分子与相互作用有关［44］，钙信号通路在细胞存活、增殖、代谢中发挥重要作用，其作用机理为Ca2+进入细胞内，激活各种Ca2+替代酶而产生作用［45-46］。研究发现，多种钙通道对于破骨细胞的分化和功能必不可少，破骨细胞分化和功能的阻断对抑制RA 骨破坏有效［47］。cAMP 信号通路又称环磷酸腺苷信号通路，典型的cAMP 信号通路是由细胞外激动剂结合特异G 蛋白偶联受体导致G 蛋白三聚体分解为G 蛋白α 亚单位和G 蛋白βγ亚单位，cAMP 与其调控亚单位结合释放催化亚单位，催化亚单位进一步磷酸化位于胞质或胞核中的底物，包括酶、离子通道、染色体蛋白和转录因子等［48］。

综上所述，本研究基于网络药理学方法对海桐皮进行化学成分数据库构建、靶点预测、药物-靶点网络构建和蛋白相互作用网络分析GO生物过程和KEGG 通路富集分析，初步阐述了海桐皮治疗RA的作用机制，但具体疗效尚需进一步验证。