肽酰精氨酸脱氨酶4和组蛋白H3瓜氨酸化与高级别脑胶质瘤的相关性研究

孔晨旭 ,李振江 ,耿慧霞 ,王来

1 河南大学 淮河医院,河南 开封 475004;2 河南大学 护理与健康学院,河南 开封 47600;3 河南大学 生命科学学院,河南开封 47600

脑胶质瘤又称为神经胶质瘤,是中枢神经系统恶性程度最高的肿瘤,WHO 将其分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ 4个级别。低级别胶质瘤向高级别类型转化、进展迅速,且具有很强的侵袭性和对化疗的不敏感性。胶质瘤的级别越高,患者的生存期越短,如Ⅳ级别胶质瘤患者的生存期一般小于15个月。多种病理机制参与胶质瘤级别的进展,如肿瘤细胞分泌胞外囊泡通过调控肿瘤微环境内细胞之间信息的交流,促进胶质瘤的级别的进展、复发、侵袭和抗药性[1]。

肽基精氨酸脱氨酶(peptidylarginine deiminases,PADs)是蛋白质翻译后加工过程中的一类同工酶,该酶可将蛋白质表面的精氨酸残基脱氨后转变为瓜氨酸残基,具有很强的底物结合特异性并且在不同的组织中发挥不同的生理功能[2]。高等生物共有PAD1、PAD2、PAD3、PAD4和PAD6等5类肽酰精氨酸脱亚胺酶亚型[3]。PAD4由于具有经典的核定位信号,推测其为唯一一个定位于细胞核内的肽基精氨酸脱氨酶,暗示其在基因表达调控方面的重要作用[4]。PAD4通过瓜氨酸化H3和H4组蛋白中的多个精氨酸残基,在中性粒细胞胞外诱捕网络(neutrophil extracellular traps,NETs)形成和机体抵御微生物入侵的先天免疫方面发挥重要作用[5]。近年的研究发现,PAD4调控组蛋白的瓜氨酸化广泛参与肿瘤的形成、发展和转移。然而,PAD4的表达水平及其介导的组蛋白3瓜氨酸化(citrullinated Histone H3,H3cit)与高级别脑胶质瘤之间的关系并不明确。本研究以脑胶质瘤患者手术标本为研究材料,观察PAD4和H3cit的表达水平与高级别脑胶质瘤的关系,以期对胶质瘤的诊断和治疗提供科学的参考。

图1 正常与高级别脑胶质瘤PAD4的表达情况

图2 正常组织与高级别脑胶质瘤组蛋白3瓜氨酸化表达情况

1 材料与方法

1.1 临床资料

选取2021年1月—2022年1月在河南大学淮河医院进行手术治疗的脑胶质瘤患者30例,其中:男22例、女8例;年龄36～72岁,平均(50.1±6.3)岁。取瘤旁正常组织为对照组。按照世界卫生组织(WHO)中的分级法对肿瘤进行分级,Ⅲ级有18例,Ⅳ级有12例。本研究已获得河南大学生物医学科研伦理分委员会的准许(HUSOM2021-0106),并获得了患者或家属的书面知情同意书。

1.2 免疫组织化学检测

将所有的组织标本用中性甲醛固定,石蜡包埋,石蜡切片机以4～5 μm的厚度切片;烤箱烤片,二甲苯脱蜡,不同梯度乙醇水化,去离子水漂洗充分。切片浸泡柠檬酸抗原修复液中,微波炉加热进行抗原修复。切片置于去离子水中浸泡,滴加内源性过氧化物酶,室温避光放置5 min,PBS缓冲液冲洗。滴加小鼠抗PAD4一抗(1∶200,Abcam,货号:128086)和兔抗H3cit一抗(1∶150,Abcam,货号:5103),37 ℃孵育2 h,PBS缓冲液冲洗3次。滴加HRP标记的抗小鼠/兔IgG二抗(中杉金桥),室温孵育30 min,PBS缓冲液冲洗。DAB显色试剂盒(Solarbio,货号:DA1010)显色。光学显微镜下观察拍照。

2 结果与分析

2.1 Ⅲ、Ⅳ级脑胶质瘤PAD4表达增加

临床标本检测(图1)显示,PAD4在细胞核内表达,但在正常组织内,表达水平较低,而Ⅲ、Ⅳ级脑胶质瘤细胞表达水平远远高于正常组织,且表达水平的高低随胶质瘤分期的增加而增加。

2.2 Ⅲ、Ⅳ级脑胶质瘤组蛋白H3瓜氨酸化增加

临床标本检测(图2)显示,Ⅲ、Ⅳ级脑胶质瘤细胞核内组蛋白3的瓜氨酸化急剧增加,而正常组织细胞的核内,组蛋白3的瓜氨酸化水平较低,且随着胶质瘤分期的增加而瓜氨酸化水平亦增加,呈现一定的正相关。

3 讨论

脑胶质瘤属于中枢神经系统高度异质性肿瘤,严重威胁人类健康,预后效果极差[6]。WHO 根据肿瘤细胞周围血管增生与细胞核分裂情况,将Ⅰ、Ⅱ级胶质瘤归为低级别,将Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤归为高级别。胶质瘤的级别越高,患者的生存期越低,其中,胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)的恶性程度最高,5 a生存期低于6.9%[7]。目前,手术切除和术后的药物化疗相结合是治疗胶质瘤的主要选择,但患者的预后依然很差[6]。随着小分子药物和抗体药物的研发和应用促使了肿瘤患者精准治疗的实现,因此探讨不同分级脑胶质瘤的特异分子更为重要[8]。

PADs的主要生物学功能是参与蛋白质翻译后精氨酸残基的瓜氨酸化。PAD4通过调控中性粒细胞组蛋白H3的瓜氨酸化从而参与胞外诱捕网络(neutrophil extracellular traps,NETs)形成,参与机体的固有免疫反应。进一步的研究表明,PAD4调控的机体多种蛋白多肽链的精氨酸残基瓜氨酸化组成了关节炎、神经退行性疾病、多发性硬化、系统性红斑狼疮和肿瘤等多种疾病的病理基础[9]。哺乳动物有5 个PADs 酶家族成员,其中PAD2 和PAD4在肿瘤的发生、发展、转移方面发挥重大作用[10]。PAD2超表达转基因鼠促进皮肤癌的形成,通过STAT3信号通路的磷酸化调控肿瘤微环境状态增强癌细胞的恶变率和转移[11-12],而PAD4调控肿瘤细胞染色质丝形成促进癌细胞的侵袭和转移[13]。对星形胶质细胞瘤的研究[14-15]也表明,PAD4的表达增高,然而并没有检测到PAD2 和PAD3表达水平的增加。本文研究结果显示,PAD4和H3cit在Ⅲ和Ⅳ级的脑胶质瘤组织比正常组织表达水平增高,且随着胶质瘤级别的增加,表达量增加明显,提示PAD4和H3cit的高表达与高级别脑胶质瘤的进展相关,有可能作为脑胶质瘤的精准治疗靶点。

外分泌体是促进胶质母细胞瘤促瘤微环境形成的主要调控因子。肽酰精氨酸脱氨酶(peptidylarginine deiminases,PADs)调控胶质细胞瘤胞外囊泡(exosomes and microvesicles,EVs)的形成,影响囊泡内分子变化,改变其功能[16]。广谱PAD 抑制剂Cl-amidine影响胶质母细胞瘤外分泌体的释放和外分泌体携带microRNA 水平,如降低促瘤microRNA21的水平,增加抗瘤microRNA126的水平。胶质母细胞瘤细胞内,观察到阻抑素瓜氨酸化的增加,从而维持细胞内线粒体稳定性和癌细胞的抗药性。广谱PAD抑制剂处理1 h后,PHB的瓜氨酸和表达水平降低,H3的瓜氨酸化也降低。这些结果提示,PAD修饰GBM 细胞内蛋白的瓜氨酸化变化及内分泌体的释放表明PADs是修饰GBM 肿瘤细胞间通讯的新的靶标[17]。不同PADs亚型的特异性抑制剂作用不同GBM 细胞系提示对外分泌体的释放和miRNA的影响是不同的,提示不同PAD的表达决定GBM 的异质性并具有潜在的特异性治疗特性[18]。这些研究结果提示,PAD4活性的小分子抑制剂有可能作为抑制胶质瘤进展的潜在治疗药物。

综上所述,PAD4和H3cit的高表达水平与高级别脑胶质瘤存在一定的相关性,对这两个蛋白分子的检测有利于高级别脑胶质瘤的病理诊断,也为脑胶质瘤患者的精准治疗提供参考依据。