低温机械灌注对大鼠肾脏炎症因子表达水平的影响

罗德 刘江 周鹏程 王飘 李栩嘉 林号民 苏松

肾移植被视为终末期肾病的最佳治疗选择。然而，器官保存过程中的缺血-再灌注损伤（ischemiareperfusion injury，IRI）严重影响移植物功能，是移植成功的主要障碍[1]。因此，减轻器官保存中的IRI 并改善器官功能成为当前移植领域亟须解决的问题。静态冷保存（static cold storage，SCS）是一种通过降低保存温度和减缓细胞代谢来实现器官保存的技术[2-3]。然而，大量研究证实，在SCS 过程中，能量耗竭、氧化应激和免疫炎症激活等因素可能导致细胞结构和功能的受损，从而引发冷缺血损伤[4-6]。这种损伤在边缘供者中尤为显著，并且随着保存时间的延长，损伤程度会进一步加重。低温机械灌注（hypothermic machine perfusion，HMP）通过持续供应氧气和能量物质，并及时清除代谢废物，能够减轻IRI 并改善器官保存质量和效果，提高移植成功率并降低移植后并发症的风险[7-8]。在IRI 中，炎症反应激活起着关键的作用，适度的炎症反应有助于组织修复和再生，但过度激活则会加剧组织损伤[9-10]。因此，控制炎症反应激活对于减轻IRI 和保护器官功能至关重要。然而，目前关于肾脏HMP 过程中炎症反应激活的研究报道非常有限。因此，本研究通过构建大鼠肾脏离体SCS 和HMP 模型，比较这两种器官保存方式对肾脏炎症因子水平的影响，为进一步研究器官保存提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂和仪器

雄性Fisher 大鼠30 只，体质量260～300 g，饲养于西南医科大学动物实验中心。组氨酸-色氨酸-酮戊二酸盐液（histidine-tryptophan-ketoglutarate solution，HTK 液）购于德国Custodiol 公司，威斯康星大学保存液（University of Wisconsin solution，UW 液）购于美国Bridge to Life 公司，QuantiTect 逆转录试剂盒购于德国Qiagen 公司，TaqMan fast universal PCR master mix 购于美国赛默飞公司，CXC 趋化因子配体（CXC chemokine ligand，CXCL）1、CXCL2、干扰素（interferon，IFN）-β1、IFN-α4、CC 趋化因子配体（CC chemokine ligand，CCL）2、CCL20、白细胞介素（interleukin，IL）-17α、IL-17C、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、β-actin 引物购于美国赛默飞公司，StepOne 逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）系统购于美国赛默飞公司，机械灌注系统购于德国Hugo Sachs Elektronik 公司。本实验通过西南医科大学附属医院伦理委员会审批（批号：20211119-067）。

1.2 实验分组及处理方式

将30 只大鼠随机分为对照组（Control 组）、SCS 组和HMP 组，每组10 只，术前自由饮水。4.5% 异氟醚深度麻醉后，打开胸腹腔并剪破心脏，经腹主动脉使用4 ℃ HTK 液冲洗肾脏，直至肾脏颜色变为均匀黄白色，剪破心脏到开始冲洗肾脏的时间大约为5 min。Control 组冲洗结束后获取肾脏置于10%多聚甲醛中固定，用于后续的病理组织学检查；SCS 组冲洗结束后获取肾脏置于4 ℃ HTK 液中保存12 h；HMP 组冲洗结束后获取肾脏置于4 ℃ HTK 液中保存12 h，再使用4 ℃ UW 液以80 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）的恒定压力进行2 h 低温机械灌注，采用95% O2、5% CO2通过纤维膜氧合器对灌注液进行氧合。

1.3 研究内容及方法

1.3.1 灌注参数 机械灌注系统能实时记录流速及肾内阻力，灌注结束后收集灌注过程中的流速和阻力数据，并用大鼠肾脏质量进行标准化后进行后续分析。灌注过程中每15 min 收集静脉流出液，并使用酸碱度测定计测量其pH 值。

1.3.2 逆转录聚合酶链反应实验 取20 mg 肾脏组织于组织裂解器中使其变成组织匀浆，使用RNAeasy Mini 试剂盒提取总RNA，分光光度计测定浓度，使用QuantiTect 逆转录试剂盒进行逆转录获得cDNA。随后使用RT-PCR 系统检测CXCL1、CXCL2、IFNβ1、IFN-α4、CCL2、CCL20、IL-17α、IL-17C、TNF-α 的CT 值。每个标本设3 个复孔，用β-actin 将每个基因平均CT 值进行标化，并使用相对定量方法计算信使RNA（messenger RNA，mRNA）的相对表达水平。

1.3.3 肾脏组织病理学检查 多聚甲醛固定肾脏，经过不同浓度的乙醇脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、脱蜡、水化、苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色后封片制成病理切片，进行病理组织学观察并对肾小管损伤进行评分。肾小管损伤采用改良的评分方法：在每张病理切片中，高倍镜下随机选取10 个非重叠区域分别对肾小管扩张、空泡形成、刷状缘缺失、上皮坏死和上皮脱落五种组织形态学变化进行半定量评估。评分标准：结构正常0 分；轻度改变为1 分（< 25%）；中度改变为2 分（25%～50%）；严重改变为3 分（> 50%）。计算10 个区域的平均分作为每张病理切片的肾小管损伤评分。

1.4 统计学方法

采用SPSS 26.0 软件进行统计学分析。对于符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，两组独立样本间比较采用非配对t检验，同一组样本灌注前后比较采用配对t检验，P< 0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 机械灌注过程中各参数变化

流速在HMP 过程中相对稳定，灌注结束时流速并未降低[（2.7±0.4） mL/（min·g）比（2.9±0.4） mL/（min·g），P=0.5，图1A]。肾内阻力在HMP 过程中均相对稳定，灌注结束时与灌注开始时比肾内阻力没有明显变化[（2 2.2±1.6）mmHg/（min·g）比（20.1±2.1） mmHg/（min·g），P=0.3，图1B]。肾静脉灌注流出液pH 值在HMP 最初阶段下降，随后保持相对稳定，灌注结束时的pH 值低于灌注开始时（7.28±0.01 比7.35±0.01，P=0.002，图1C）。

图1 HMP 过程中各参数变化Figure 1 Changes of parameters during HMP

2.2 各组肾脏炎症因子mRNA 表达水平比较

与Control 组比较，SCS 组和HMP 组CXCL1、CXCL2、CCL2、CCL20、IL-17α、IL-17C、TNFα 的mRNA 相对表达量升高；与SCS 组比较，HMP 组CXCL1、CXCL2、CCL2、CCL20、IL-17α和 TNF-α 的mRNA 相对表达量升高（均为P< 0.05，图2）。

图2 各组肾脏炎症因子mRNA 表达水平Figure 2 mRNA expression levels of inflammatory factors of kidneys in each group

2.3 各组肾脏组织病理学结果的比较

肾脏组织切片HE 染色结果显示，Control 组肾小管刷状缘完整，管腔无细胞碎片，细胞形态正常；SCS 组存在大量的细胞质广泛空泡化、刷状缘缺失、上皮坏死、上皮脱落、管腔阻塞，肾小管损伤严重；HMP 组仅有少量刷状缘丢失和上皮脱落，肾小管损伤轻微（图3）。

图3 各组肾脏组织病理学改变（HE，×400）Figure 3 Histopathological changes of the kidney tissues in each group

Control 组肾小管损伤评分为（0.34±0.11）分，低于SCS 组的（6.20±0.59）分和HMP 组的（4.10±0.76）分，而HMP 组肾小管损伤评分低于SCS 组（均为P< 0.05）。

3 讨 论

肾移植仍然是终末期肾病的最佳治疗选择，能够改善患者生活质量和延长寿命[11-12]。供者短缺是目前器官移植面临的巨大挑战[13-15]。边缘供者被迫用以补充供者池以改善供者短缺的窘境，这类供者对保存过程中的IRI 更加敏感，术后移植物无功能发生率更高[16-17]。随着Collins 液、UW 液、HTK 液等器官保存液相继开发和改进，SCS 成为了目前常用的器官保存方式，被多数器官移植中心广泛使用[18-19]。SCS 主要通过降低温度来抑制细胞代谢，然而长时间SCS 可能会导致细胞活力丧失甚至坏死[20-21]。冷保存时间越长，器官遭受的损伤越严重，特别是对于边缘供器官，这大大降低了SCS 的效果[22-24]。近年来，研究人员开始更加关注HMP，它不仅可以保存器官，改善器官功能，还可用于评估器官功能[25-28]。本研究结果表明，HMP 虽然激活了肾脏的炎症反应，但减轻了肾脏冷保存损伤。靶向调控HMP 过程中的炎症反应为进一步改善器官功能提供了新的思路。

肾脏机械灌注过程中的血流动力学变化是一个重要的功能参数，可用于评估灌注效果和肾脏损伤程度[6]。由于体外灌注过程中灌注压力恒定，因此流速与肾内阻力成反比。本研究发现，灌注过程中肾内阻力相对稳定，无明显变化。Blum 等[29]对猪肾脏进行8 h 的HMP，也发现灌注过程中肾内阻力保持基本稳定。IRI 过程中存在多种炎症因子的释放和激活，如细胞因子TNF-α、IFN-β1、IFN-α4、IL-17α、IL-17C，趋化因子CXCL1、CXCL2、CCL2、CCL20[30]。这些炎症因子在IRI 中发挥着重要的作用，调控这些炎症因子有助于减轻IRI，改善器官保存和移植效果。对机械灌注过程中炎症因子的研究，有助于深入理解机械灌注对器官的影响，并为开发相关的治疗策略提供基础。目前，对于机械灌注过程中移植物炎症细胞因子的变化，大部分研究集中在常温机械灌注（normothermic machine perfusion，NMP）[31]，对于HMP 过程中炎症因子的变化研究非常有限。一项包括293 例肝移植受者的随机临床多中心试验数据显示，相比于SCS，NMP 能显著减轻肝小叶炎症，减轻IRI[32]。Beetz 等[33]研究发现，相比于SCS，6 h的NMP 明显提高了猪肝IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6和IL-18 的表达水平。然而，Fontes 等[34]研究表明，与SCS 相比，机械灌注明显降低猪肝IFN-α、IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-4 和IL-12 的水平。Jager 等[35]分别对猪和人的肾脏进行4 h 和 6 h 的NMP，每小时采集灌注液样本以评估促炎因子变化水平，发现IL-6、IL-8 和TNF 在NMP 期间显著增加。Yang 等[36]使用夹闭兔子肾脏25 min 模拟热缺血损伤，SCS 组松开夹子再灌注29 h 后在4 ℃高渗柠檬酸腺嘌呤溶液-Ⅱ溶液（hypertonic citrate adenine solution-Ⅱ，HCA-Ⅱ溶液）中进行6 h 的SCS，NMP 组松开夹子恢复血流1 h，然后再进行HMP 保存6 h，结果发现与SCS 组相比，HMP 组核因子（nuclear factor，NF）-κB 和TNF-α 的表达明显降低。然而本研究发现与S C S 组相比，H M P 组肾脏多种促炎因子mRNA 表达水平显著升高，且HMP 能减轻冷保存损伤，研究结果的差异可能与两个实验方案中热缺血时间、保存液种类以及保存时间不同有关。

赵德芳等[37]比较了SCS 和HMP 对犬肝脏炎症因子水平的影响，发现移植后HMP 组肝脏IL-1β、TNF-α、IL-8、巨噬细胞炎症蛋白（macrophage inflammatory protein，MIP）-1α、MIP-1β、CCL20 的mRNA 表达水平明显低于SCS 组，而在移植前的肝脏中只有TNF-α、MIP-1α、MIP-1β、CCL20 的mRNA 表达水平差异有统计学意义。本研究采用大鼠肾脏作为实验对象，实验设计也有所不同，获取的肾脏置于4 ℃的HTK 液中保存12 h，而赵德芳等[37]对移植前的肝脏采用生理盐水保存约3 h。此外，本研究中的HMP 组肾脏在SCS 12 h后，继续进行2 h 的HMP，而SCS 组仅接受了12 h的SCS，因此HMP 组肾脏的冷缺血时间更长。这可能是导致HMP 组肾脏炎症因子表达水平明显升高的原因。相较于SCS，虽然HMP 升高了肾脏炎症因子的mRNA 表达水平，但改善了肾脏病理损伤，这可能与HMP 降低移植物代谢率、提供氧气、清除代谢产物、维护细胞膜稳定性和抗氧化等多种机制有关。

综上所述，肾脏移植物在HMP 期间的炎症反应被激活，在HMP 过程中降低移植肾的免疫炎症活性有望进一步提高机械灌注效果，改善移植物存活率。