暖季补饲矿物质盐砖对放牧牦牛瘤胃发酵和微生物区系的影响

■ 杨得玉 黄文植 薛 斌 张晓卫 崔占鸿 冯宇哲

（青海大学畜牧兽医科学院，农业农村部青藏高原放牧牦牛藏羊动物营养与饲草料重点实验室，青海省牦牛工程技术研究中心，青海省高原放牧家畜动物营养与饲料科学重点实验室，青海西宁 810016）

作为青海、西藏等高海拔地区的象征，1 400多万头牦牛为当地牧民提供了基本的生存资源[1]。其构成了高原畜牧业的主要支柱，不仅作为当地牧民赖以生存的物质基础，也是藏区特色优势产业的发展重点[2-3]。牦牛主要以放牧为主，依靠天然牧草获取所需的各种营养物质。但是由于高寒牧区牧草生长期短而枯草期较长，牧草养分不平衡，导致牦牛生长缓慢[4-5]。牦牛在暖季具有补偿生长能力[6]，研究表明，在暖季进行补饲可以提高牦牛体况，更好地发挥其生长潜力，达到短期育肥的目的。传统放牧生产模式虽然有诸多优点，但高寒草甸天然牧草营养呈季节性变化，甚至每个月都有差异，致使这一模式低效。

补饲是目前提高牦牛养殖效益的一种有效措施。由于高寒草甸的特殊性，对于牦牛冷季补饲的探究已经较为深入。针对青年牦牛和母牦牛，主要补充干草、精料、青贮、舔砖等[7-11]，关于牦牛犊牛也有报道[12-13]，结果均表明冷季进行补饲能延缓掉膘。虽然在牦牛暖季补饲方面已有一些报道，主要对生长期牦牛进行补饲，探究其生长性能，但对牦牛暖季的营养补饲探究其机理的研究仍较少。矿物质的补饲有多种形式，常见的形式是预混料添加剂，制成全价饲料进行补饲，也有通过不同添加形式进行补饲[14]，如瘤胃缓释弹丸用以预防微量元素的缺乏[15]。常用的是制成舔砖进行补饲。舔砖的种类各异，一般根据成分来命名，如盐砖、糖蜜砖、尿素营养舔砖。已有研究证实，补饲矿物质对牦牛瘤胃发酵有促进作用[16]。因此，本试验通过对放牧牦牛进行暖季补饲矿物质盐砖，从微观上探究瘤胃发酵和瘤胃微生物区系的变化，以期充分发挥放牧牦牛的生长潜力，提高生产性能，为高寒草甸牦牛的矿物质营养研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验设计与饲养管理

试验时间为2020年7月16日—2020年10月31日。试验地点为青海省海晏县达日玉秀乡高寒草甸区，草地类型为高寒草甸草地，草地优势种有高山嵩草、垂穗披碱草和草地早熟禾，伴生种有大花蒿、多裂委陵菜、翠雀花、黄帚橐吾、紫花针茅和芨芨草等。

选取体重接近的2.5 岁健康公牦牛12 头，随机分为2组，每组6头。对照组牦牛全天放牧，盐砖组牦牛放牧并补饲矿物质盐砖，自由舔食。围栏内放置饮水槽，并保证饮水干净充足，两组牦牛自由饮水。预试期15 d，正试期90 d。本试验天然牧草的营养含量和矿物质含量见表1 和表2，矿物质盐砖的主要矿物质成分见表3。

表1 天然牧草常规营养成分含量（干物质基础，%）

表2 天然牧草矿物质含量（干物质基础, mg/kg)

表3 矿物质盐砖的主要矿物质成分

1.2 样品采集

牧草采集：试验前根据牦牛的采食路线圈定采样区域，采用对角线法采集多个0.25 m×0.25 m 大小样方的牧草，混匀并在65 ℃烘干，并粉碎过筛保存，用于牧草养分分析。

瘤胃液采集：采样前禁食8 h，使用胃管式瘤胃液采样器采集每头试验牛的瘤胃液样品。先将试验牛保定，避免乱动。然后将干净的胃管式瘤胃液采样器从口腔插入，到达瘤胃后用150 mL大型注射器抽取瘤胃液，舍弃前两管，采集完毕后，缓慢将采样器抽出。随后立即将注射器中瘤胃液移入15 mL 冻存管中，测定pH，其余放入液氮，用于氨态氮（NH3-N）、挥发性脂肪酸（VFA）浓度的测定和16S rRNA测序分析。

1.3 指标测定

1.3.1 牧草常规营养成分含量测定

粗灰分（Crude ash，Ash）：GB/T 6438—2007《饲料中粗灰分的检测》；粗蛋白（Crude protein，CP）：GB/T 6432—2018《饲料中粗蛋白质的测定 凯氏定氮法》；粗脂肪（Ether extract，EE）：GB/T 6433—2006《饲料中粗脂肪的测定》；中性（酸性）洗涤纤维（Neutral detergent fiber，NDF/Acid detergent fiber，ADF）：GB/T 20806—2006《饲料中中性洗涤纤维（NDF）的测定》。

1.3.2 牧草和矿物质盐砖矿物质元素测定磷（Phosphorus，P）：GB/T 6437—2018《饲料中总磷的测定 分光光度法》；主要矿物质元素：GB/T 13885—2017《饲料中钙、铜、铁、镁、锰、钾、钠和锌含量的测定 原子吸收光谱法》，使用仪器为普析TAS-990原子吸收分光光度计。

1.3.3 牦牛盐砖采食量测定

将盐砖组各头牦牛采食的盐砖固定好，确保每头牛每天舔食同一块盐砖，采食前记录每块盐砖的重量，在试验进行30、60 d和90 d时对盐砖称重，并计算试验期间盐砖的采食量。

1.3.4 生长性能的测定

试验期开始前对所有牦牛进行空腹称重，记录初始重，在试验进行30、60、90 d 时空腹称重并记录，并计算试验期间的日增重。

1.3.5 瘤胃发酵指标测定

NH3-N含量：采用冯宗慈等[17]改进的比色法测定。

VFA 浓度：使用徐晓峰[18]的测定方法，使用仪器为岛津GC 2014气相色谱仪。

16S rRNA 测序：委托北京诺禾致源科技股份有限公司测序分析。

1.4 数据统计分析

试验数据采用Excel 2016 软件初步处理后，用SPSS 统计软件中ANOVA 进行单因素方差分析，用Duncan’s法进行多重比较和显著性分析，数据结果用“平均数±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 暖季补饲矿物质盐砖对放牧牦牛生长性能的影响

由表4 可知，盐砖组牦牛矿物质盐砖的平均日采食量为16 g左右。

表4 矿物质盐砖采食量（g）

由表5 可知，试验第30 天对照组、盐砖组放牧牦牛体重无显著差异（P>0.05）；试验第60、90 天盐砖组牦牛平均体重显著高于对照组（P<0.05）；放牧牦牛平均日增重盐砖组显著高于对照组（P<0.05）。

表5 暖季补饲矿物质盐砖对放牧牦牛生长性能的影响

2.2 暖季补饲矿物质盐砖对放牧牦牛瘤胃发酵的影响

由表6 可知，随着牧草营养成分的变化，对照组的pH 呈升高趋势，而盐砖组瘤胃液的pH 呈先下降后上升的趋势，试验第30 天两组瘤胃液的pH 差异不显著（P>0.05），试验第60、90 天盐砖组瘤胃液的pH（分别为7.41、7.54）显著低于对照组（7.59、7.70）（P<0.05）。随着牧草营养成分的变化，牦牛瘤胃发酵后的NH3-N 呈降低的趋势，盐砖组的NH3-N 含量显著高于对照组（P<0.05）。试验第30 天盐砖组牦牛瘤胃发酵后的丁酸、戊酸、异戊酸、总挥发性脂肪酸含量显著高于对照组（P<0.05），乙酸、丙酸、乙丙比、异丁酸两组间差异不显著（P>0.05）；试验第60 天盐砖组牦牛瘤胃发酵后的乙酸、丁酸、戊酸、异戊酸、总挥发性脂肪酸含量显著高于对照组（P<0.05），丙酸、异丁酸、乙丙比两组间差异不显著（P>0.05）；试验第90 天盐砖组乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸、总挥发性脂肪酸含量显著高于对照组（P<0.05），异丁酸、乙丙比两组间差异不显著（P>0.05）。试验30、60、90 天盐砖组牦牛瘤胃发酵后乙酸含量比对照组分别提高了15.06%、20.23%、36.05%；丙酸含量分别提高了10.69%、13.02%、29.90%，丁酸含量分别提高了63.16%、48.91%、46.21%，异丁酸含量分别提高了27.27%、4.44%、3.70%，总挥发性脂肪酸含量提高了19.24%、55.07%、32.91%。

表6 暖季补饲矿物质盐砖对放牧牦牛瘤胃发酵的影响

2.3 暖季补饲矿物质盐砖对放牧牦牛瘤胃微生物区系的影响

对所有样本的有效序列，以97%的一致性进行OUTs 聚类，再将OUTs 的序列进行物种注释。稀释曲线见图1，由图1可知，当测序深度达到53 500测序片段数时，对照组和盐砖组的稀释曲线趋于平缓，说明测序所得数据量已经覆盖样本中的绝大多数细菌物种。

图1 暖季放牧牦牛瘤胃细菌稀释曲线

2.3.1 基于OUTs的韦恩图分析

基于OUTs 韦恩图图2 可以看出，试验第30 天对照组、盐砖组OTUs 数分别为4 289 个、3 929 个，两组共享3 439 个，对照组特有OTUs 859 个，盐砖组特有OTUs 490 个；试验第60 天对照组、盐砖组OTUs 数分别为3 978个、3 900个，两组共享3 392个，对照组特有OTUs 586个，盐砖组特有OTUs 508 个；试验第90 天对照组、盐砖组OTUs 数分别为3 656 个、5 116 个，两组共享3 203 个，对照组特有OTUs 453 个，盐砖组特有OTUs 1 913个。

图2 韦恩图

2.3.2 暖季补饲矿物质盐砖对放牧牦牛瘤胃微生物群落α多样性的影响

Ace、Chao1 指数代表菌群丰富度，其值越大，表明物种总数越多，Shannon、Simpson 指数代表菌群多样性，指数越大表明物种多样性越高，各物种分配越均匀[19]。由表7 可知，补饲矿物质盐砖对放牧牦牛瘤胃菌群丰富度估计值（Ace、Chao1 指数）试验第30、60 天盐砖组的物种总数与对照组差异不显著（P>0.05），试验第90 天盐砖组显著高于对照组（P<0.05）；Shannon 指数除试验第60 天对照组显著高于盐砖组（P<0.05），其他时间段两组没有显著差异（P>0.05）；Simpon指数组间没有显著差异（P>0.05）。

表7 数据预处理结果

2.3.3 放牧牦牛瘤胃细菌β多样性分析

由图3 可知，基于属水平上的PCoA 分析，试验第30、60、90天盐砖组和对照组样品的间距较小，说明同组样品间菌落结构差异较小，结果显示PCoA1占总变异的35.57%，PCoA2差异占总变异的14.86%。

图3 放牧牦牛瘤胃细菌的主坐标分析（PCoA）

2.3.4 暖季补饲矿物质盐砖对放牧牦牛瘤胃细菌门水平组成的影响

由图4可知，含量前十的门分别为拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobiota）、未鉴定菌门（unidentified_Bacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、纤细菌门（Gracilibacteria）、螺线体门（Spirochaetota）、互养菌门（Synergistota）、广古菌门（Euryarchaeota）。试验第30、60、90 天对照组和盐砖组以拟杆菌门（分别为 51.59%、55.95%、57.58% 和 54.40%、59.34%、52.25%）、厚壁菌门（分别为31.10%、30.24%、25.53%和30.56%、26.81%、24.52%）、变形菌门（分别为0.91%、1.01%、1.64%和1.46%、1.28%、4.64%）、疣微菌门（分别为3.14%、2.18%、4.05%和2.46%、2.06%、3.93%）、未鉴定菌门（分别为2.97%、1.43%、1.73%和1.88%、1.43%、3.54%）、放线菌门（分别为2.40%、2.11%、1.47%和1.84%、1.85%、2.13%）相对丰度较高（相对丰度≥1%）。值得注意的是，变形菌门在盐砖组的含量高于对照组。

图4 放牧牦牛瘤胃细菌门水平相对丰度

2.3.5 暖季补饲矿物质盐砖对放牧牦牛瘤胃细菌属水平的影响

由图5 可知含量前十的属分别为普雷沃氏菌属（Prevotella）、理研菌属RC9（Rikenellaceae_RC9_gut_group）、普雷沃氏菌UCG-001（Prevotellaceae_UCG-001)、奎因氏菌属（Quinella）、克里斯滕森菌R-7（Christensenellaceae_R-7_group）、普雷沃氏菌UCG-003（Prevotellaceae_UCG-003）、拟 杆 菌属（Bacteroides）、Candidatus Saccharimonas、Qscillospira、杆菌属（Bacillus）。数据表明，试验第30、60、90 天对照组和盐砖组以普雷沃氏菌属（分别为17.41%、11.11%、13.87%和14.03%、13.20%、11.45%）、理研菌属RC9（分别为7.29%、9.44%、12.45% 和7.72%、10.99%、11.88%）、普雷沃氏菌UCG:001（分别为2.44%、5.90%、2.87%和2.71%、3.83%、3.53%）、奎因氏菌属（分 别 为2.47%、3.04%、1.41% 和2.75%、1.90%、1.87%）、克里斯滕森菌R-7（分别为4.09%、4.02%、3.77%和3.77%、1.90%、1.87%）、普雷沃氏菌UCG-003（分别为1.71%、3.01%、2.75%和2.21%、3.29%、2.53%）、拟杆菌属（分别为0.77%、1.65%、2.19%和1.48%、1.04%、1.71%）相对丰度较高（相对丰度≥1%）。

图5 放牧牦牛瘤胃细菌属水平相对丰度

2.3.6T检验

由图6 可以看出，试验60 d 对照组和盐砖组主要的差异菌门是广古菌门，试验第90 天对照和盐砖组主要的差异菌门是变形菌门，通过对比，试验第60 天盐砖组的广古菌门丰度显著高于对照组（P<0.05），试验第90 天盐砖组的变形菌门丰度显著高于对照组（P<0.05）。

图6 T检验两组间物种差异分析（门水平）

由图7可以看出，试验第60天对照组和盐砖组主要的差异菌属是普雷沃氏菌UCG-005 和甲烷短杆菌属，试验第90 天对照组和盐砖组主要的差异菌属有克里斯滕森菌R-7、Candidatus Saccharimonas、欧陆森氏菌属、Saccharofermentans和解琥珀酸菌属，通过对比，试验第60 天对照组的普雷沃氏菌UCG-005 丰度显著高于盐砖组（P<0.05），盐砖组的甲烷短杆菌属显著高于对照组（P<0.05）；试验第90天对照组的克里斯滕森菌R-7、Candidatus Saccharimonas、欧陆森氏菌属、Saccharofermentans和解琥珀酸菌属丰度显著高于盐砖组（P<0.05）。

图7 T检验两组间物种差异分析图（属水平）

2.3.7 细菌群落结构线性判别（LEfSe）分析

图8 中，LDA 分支大于阈值（阈值为3）的显著差异物种，即组间具有统计学差异的生物标识，筛选出两组之间显著差异物种，再以图9 展示出各层次水平中存在组间差异的微生物群落或物种结构，最终可知，试验第30天盐砖组与对照组相比共有8种差异显著的菌，其中拟杆菌科（Bacteroidaceae）、拟杆菌属、肠杆菌门（Enterobacterales）、肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、副乳杆菌目（Lactobacillales）、terium_enrichment_culture_clone-HN117 等菌属的丰度较对照组显著增加（P<0.05）；试验第60天对照组与盐砖组相比共有7 种差异显著的菌，其中布劳特氏菌属（Blautia）、真杆菌属（Eubacterium_coprostanoligenes_group）、韦荣球菌科（Veillonellaceae）、RF39、芽孢杆菌纲（Bacilli）、细菌（Bacteria）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）的丰度显著高于盐砖组（P<0.05），盐砖组与对照组相比共有6 种差异显著的菌，其中Archaea、广古菌门、甲烷杆菌科（Methanobacteriaceae）、甲烷杆菌纲（Methanobacteria）、甲烷杆菌目（Methanobacteriales）、甲烷杆菌属（Methanobrevibacter）的丰度较对照组显著增加（P<0.05）；试验第90 天对照组与盐砖组相比共有19 种异显著的菌，其中Saccharimonadia、Saccharimonadales、Saccharimonadaceae、Candidatus_Saccharimonas、副 杆菌科（Parabacteroides_merdae）、欧陆森氏菌属（Olsenella）、Atopobiaceae、科氏杆菌（Coribacteriia）、红蝽菌目（Coriobacteriales）、甲烷杆菌属、古生菌（Archaea）、广古菌门、甲烷杆菌纲、甲烷杆菌目、甲烷杆菌科、克里斯滕森菌目（Christensenellales）、克里斯滕森菌科（Christenellaceae）、克里斯滕森菌R-7、拟杆菌（Bacteroidales_BS11_gut_group）等菌丰度较SG 组显著增加（P<0.05），盐砖组与对照组相比共有12种差异显著的菌，其中变形菌门、变形菌纲（Gammaproteobacteria）、芽孢杆菌纲、放线菌门、酸微菌纲（Acidimicrobiia）、α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）、微球菌目（Micrococcales）、微球菌科（Micrococcaceae）、细菌、红细菌目（Rhodobacterales）、红细菌科（Rhodobacteraceae）、纤维素单胞菌科（Cellulomonadaceae）等菌丰度显著高于对照组（P<0.05）。

图8 差异物种的LDA值分布柱状图

图9 进化分支图

3 讨论

3.1 暖季补饲矿物质盐砖对放牧牦牛生长性能和瘤胃发酵的影响

对于放牧牦牛而言，牧草矿物元素的季节性缺乏将直接影响牦牛的生长。补充矿物质盐砖则会平衡牧草导致的矿物质缺乏，而体重能直接反映牦牛生长及育肥效果。研究发现，补充矿物质能促进牦牛的生长发育[20]，暖季补饲矿物元素能显著提高牦牛犊牛[21]、生长期牦牛[22]和母牛[23]的生长性能。本试验的结果与上述研究一致。这正说明在暖季补饲矿物质能够促进放牧牦牛的生长。

瘤胃液pH 是评价反刍动物瘤胃内环境与机体健康最为直观的指标。反刍动物瘤胃液pH 的正常范围为6.0～7.5[24-25]。本试验中各月份放牧组牦牛瘤胃液pH 高于7.5，研究表明低能量水平饲粮瘤胃液pH 要高于高能量饲粮瘤胃pH[26]，本研究牦牛主要采食天然牧草，其能量水平低于精料日粮，这可能是导致瘤胃液pH高的原因。

本试验测得试验第30、60 天瘤胃液中NH3-N 浓度范围是6～8 mg/dL，试验第90 天瘤胃中NH3-N 浓度范围为3.8～5.5 mg/dL，与郭天龙等[27]测出的结果相符。补饲矿物质盐砖的牦牛组NH3-N 含量显著高于未补饲组，补饲盐砖组牦牛对牧草CP、EE的消化率提高，提升了氮利用率，从而也显著提高了NH3-N含量。此外，矿物质添加提高了放牧牦牛瘤胃NH3-N 含量，但其机理还需进一步研究。

VFA 是反刍动物主要能量来源[28]，研究发现，对公牛[29]、奶牛[30]、山羊[31]补充矿物质，能提高乙酸、总挥发性脂肪酸的含量，这与本研究结果一致。本研究中，8、9、10月补饲矿物质盐砖牦牛组瘤胃乙酸含量比未补饲组分别提高了15.06%、20.23%、36.05%；丙酸含量分别提高了10.69%、13.02%、29.9%，丁酸含量分别提高了63.16%、48.91%、46.21%，异丁酸含量分别提高了27.27%、4.44%、3.70%，总挥发性脂肪酸含量提高了19.24%、55.07%、32.91%。暖季放牧牦牛补充矿物质盐砖明显提高了VFA的含量。

3.2 暖季补饲矿物质盐砖对放牧牦牛瘤胃微生物区系的影响

16S rRNA 高通量测序技术利用其在不同菌种中序列的多样性来鉴定菌种的类别[32]。本研究通过检测暖季补饲矿物质盐砖对放牧牦牛瘤胃微生物菌群的变化，来评价补饲矿物质盐砖对放牧牦牛微生物菌群是否有积极影响。本试验两试验组第30、60、90 天的优势菌群均为拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门，与前人研究结果相似[33-36]。盐砖组试验第30、60天拟杆菌门丰度与对照组相比有所增加，但差异不显著；两组间厚壁菌门丰度差异不显著。研究发现，拟杆菌门主要作用是对非纤维物质的降解，而厚壁菌门主要作用是对纤维物质的降解[37]。盐砖组、对照组的优势菌属均为普雷沃氏菌属，两组间差异不显著。根据T检验，在门水平下，试验第60 天盐砖组的广古菌门丰度显著高于对照组。广古菌门主要作用是产生甲烷，有研究表明，瘤胃中产气量越高，表明饲料在瘤胃内的发酵程度越高[38]。试验第90 天盐砖组的变形菌门丰度显著高于对照组。根据LEfSe 分析，试验第90 天对照组牦牛瘤胃中甲烷杆菌纲、甲烷杆菌目、甲烷杆菌科的相对丰度显著高于盐砖组。瘤胃产甲烷杆菌在生长过程中会产生甲烷，甲烷的产生不仅造成了动物饲料能量的浪费，也增加了温室气体排放。有研究表明，克里斯滕森菌科、克里斯滕森菌 R-7 与血清中的甘油三酯成反比关系[39]。

综合以上结果表明，补饲矿物质盐砖能降低瘤胃甲烷杆菌、克里斯滕森菌科、克里斯滕森菌R-7 等菌的相对丰度，提高了变形菌门、放线菌门、红细菌科、纤维素单胞菌科等菌的相对丰度。

4 结论

暖季补饲矿物质盐砖降低了放牧牦牛瘤胃液pH，显著升高了其瘤胃NH3-N 的浓度及瘤胃VFA 的含量，提高了能量的利用，促进了瘤胃发酵。