不同添加剂对苜蓿与花生秧混合青贮体外发酵特性的影响

■ 孙 宇 祖晓伟 韩 旭 吴春会 李秋凤 杨燕燕 王明亚*

（1.河北农业大学动物科技学院，河北保定 071000；2.河北省畜牧总站，河北石家庄 050000；3.承德鱼儿山承垦农业发展有限公司，河北承德 067000）

紫花苜蓿富含蛋白质，氨基酸组成优良，营养价值高，易于消化，畜禽喜采食，对动物健康具有重要意义[1]，在动物生产中能够代替部分精料，是奶牛重要的优质饲草[2]，常青贮保存。但是，新鲜苜蓿水分含量高，附生菌少，发酵底物不足，导致苜蓿直接青贮难以成功，在生产实践中，常将水分控制在50%，进行半干青贮。然而，河北省大部分地区，苜蓿刈割季节多逢雨季，刈割的苜蓿不利于晾晒萎蔫，同时还耗费大量的人力，而混合青贮可以有效避免这种情况。前人研究已表明，将苜蓿与低水分饲草（如稻壳、麦麸等）混合青贮能够改善青贮品质，但未见苜蓿与花生秧混合青贮的报道[3]。花生秧作为农业资源废弃物，营养价值丰富，粗蛋白含量高，纤维品质好，质地松软，适口性佳，是一种优质的粗饲料资源，近年来，花生秧已逐渐被应用至反刍动物的生产中[4]。所以本试验选择将苜蓿与花生秧混合青贮。

苜蓿与花生秧均属豆科植物，可溶性碳水化合物（WSC）含量低，因此添加纤维素酶，以期将纤维素、半纤维和木质素等物质降解为单糖或双糖，增加发酵底物。由于苜蓿与花生秧的附生菌较少，人工添加植物乳杆菌，保证青贮初期发酵所需的乳酸菌数量，使之尽快、尽早进入乳酸发酵阶段。魏晓斌等[5]研究表明纤维素分解酶与乳酸菌的联合使用效果好于两者单独使用。单宁能够抑制微生物的活动及酶的活性，并能够与蛋白质结合，形成络合蛋白，在青贮过程中能够降低CP 降解[6]。Chen 等[7]研究表明，将苜蓿分别添加5个单宁水平（0、10、20、40、60 g/kg DM）青贮，结果表明，添加单宁的量不宜超过40 g/kg DM，且此时青贮效果最佳。

纤维素酶、植物乳杆菌和单宁能够改善苜蓿与花生秧混合青贮的品质，但对动物消化利用的影响尚不明确，本试验通过体外发酵试验，探究添加纤维素酶、植物乳杆菌和单宁及其不同组合使用，对紫花苜蓿与花生秧混合青贮后体外发酵特性的影响，以期筛选出适宜的添加剂，为调控紫花苜蓿与花生秧混合青贮料在反刍动物瘤胃发酵提供依据。

1 材料与方法

1.1 饲料及添加剂

紫花苜蓿刈割于河北农业大学教学基地，品种为WL358，第三茬（2022 年7 月29 日），收割时期为现蕾期，留茬高度7～8 cm，铡短长度2～3 cm。花生秧购自河北省保定市唐县某农场，为风干花生秧，干物质含量为92.86%。添加剂所用单宁为复配水解单宁，纯度>93%，购自河南万邦化工科技有限公司；纤维素酶的酶活为10 000 U/g，由李氏木霉深层发酵生产，购自夏盛实业集团，植物乳杆菌活菌数为1×1010CFU/g，购自天益生物科技有限公司。

紫花苜蓿与花生秧以7∶3 比例均匀混合，其营养水平见表1。

表1 苜蓿与花生秧混合原料的营养水平（干物质基础）

1.2 瘤胃液供体动物及饲养管理

保定市满城宏达牧业3 头带有永久性瘤胃瘘管的荷斯坦阉牛为瘤胃液供体，每天饲喂2 次，自由饮水。其日粮组成及营养水平见表2。

表2 饲粮组成及营养水平（干物质基础）

1.3 试验设计

将紫花苜蓿与花生秧以7∶3 比例混合青贮，将添加剂均匀喷洒于青贮料上，混合均匀后装入250 mm×350 mm 聚乙烯袋抽真空青贮，每袋青贮原料400 g，室温青贮45 d，青贮结束后，将青贮样在65 ℃烘箱干燥至恒重，室内回潮，制成风干样，粉碎，然后过20 目筛，称取0.5 g 装入ANKOM F57 纤维袋，放入发酵瓶中进行体外产气试验，体外发酵48 h，共8 个处理，每个处理8个重复。各处理组添加量见表3。

表3 试验设计

1.4 体外瘤胃培养

1.4.1 人工瘤胃液的配制

在保定市满城宏达牧业选用3 头体重相近、带有永久性瘤胃瘘管的荷斯坦阉牛为瘤胃液供体，于晨饲前采集瘤胃液，经4 层纱布过滤至预热保温瓶内，并不断充入CO2隔绝空气，采集完毕迅速带回实验室。将预处理好的装有青贮样品的ANKOM F57纤维袋放置到100 mL 发酵瓶中，在39 ℃恒温气浴摇床中进行预热处理，每个处理8 个重复。再按照Menke 等[8]方法配制的厌氧人工瘤胃缓冲液，然后使其与采集的瘤胃液以3∶1 比例混合制成人工瘤胃混合发酵液（操作过程始终保持厌氧条件）。取60 mL人工瘤胃混合发酵液倒入提前预热好的发酵瓶中，盖紧盖子，并放置在39 ℃的恒温气浴摇床中进行发酵（操作过程始终保持厌氧条件），测量2、4、6、8、12、24、36、48 h 发酵瓶的压力值。每种处理在培养48 h 时取出发酵瓶进行冰水浴终止发酵，发酵液分装至2 个15 mL 离心管和2 个10 mL 离心管中，用于测定氨态氮（NH3-N）和挥发性脂肪酸（VFA）。同时将发酵瓶中纤维袋取出，冲洗至冲洗液无色，于烘箱中65 ℃烘至恒重，测定干物质降解率（DMD）、中性洗涤纤维降解率（NDFD）、酸性洗涤纤维降解率（ADFD）、CP 降解率（CPD）。

1.4.2 体外瘤胃发酵指标

pH使用 UB-7 型精确酸度计（美国）测定；NH3-N采用冯宗慈等[9]比色法进行测定；瘤胃液预处理参照王加启[10]的方法，用安捷伦7890A 气相色谱仪（美国）测定瘤胃发酵液中的VFA 的含量，标品选择2-乙基丁酸。

1.4.3 体外降解率指标

式中：DMD——干物质消化率（%）；

M1——体外前样品重量（g）;

A——体外前样品干物质含量（%）；

M2——体外后样品重量（g）;

B——体外后样品干物质含量（%）。

式中：D——某营养物质降解率（%）；

m1——体外前该营养物质的含量（g）;

m2——体外后该营养物质的含量（g）。

1.4.4 体外产气量及产气参数指标

使用HT-935专业压差测量仪记录产气量发酵瓶压力值（Psi），每次测量结束排空发酵瓶中气体，通过空白瓶校正，计算48 h累计产气量[11]。

GP=0.18+3.697Pt+0.082 4Pt2

式中：GP——t时间总产气体积（mL）；

Pt——t时间压力值（Psi）。

1.5 数据处理

试验数据采用Excel 2013 进行计算处理，结果用“平均值±标准误”表示，利用SPSS 23.0进行显著性方差分析，数据采用ANOVA-单因素进行方差分析，并利用邓肯氏多重比较法对数据进行多重比较。P<0.05为差异显著，P>0.05为差异不显著。

2 结果与分析

2.1 不同添加剂对紫花苜蓿与花生秧混合青贮的体外发酵pH和NH3-N的影响

由表4 可知，pH 差异不显著（P>0.05），处理组的NH3-N 含量均显著低于CK 组（P<0.05），其中，Ta 组NH3-N 含量显著低于Lp、Ce、Lp+Ce 组，显著高于Lp+Ta、Ce+Ta、Lp+Ce+Ta组（P<0.05）。

表4 不同添加剂对紫花苜蓿与花生秧混合青贮体外发酵pH和NH3-N影响

2.2 不同添加剂对紫花苜蓿与花生秧混合青贮体外发酵VFA含量的影响

由表5 可知，与CK 组相比，Ce、Ce+Lp、Ce+Ta、Ce+Lp+Ta组的乙酸/丙酸显著降低（P<0.05）。Ce+Ta、Ce+Lp+Ta 组的丁酸含量显著低于Ce、Ce+Lp 组，且显著高于其他处理组（P<0.05）。Ce、Ce+Lp 组的戊酸含量显著高于其他处理组（P<0.05）。Ta 组的TVFA显著低于CK、Ce、Lp、Ce+Lp、Lp+Ta、Ce+Lp+Ta组（P<0.05）。

2.3 不同添加剂对紫花苜蓿与花生秧混合青贮体外发酵产气量的影响

由表6 可知，发酵24 h 时，CK、Ce、Lp+Ce 组的产气量显著高于其他各处理组（P<0.05），发酵36、48 h时，CK、Lp、Ce、Lp+Ce 组的产气量均显著高于Ta、Lp+Ta、Ce+Ta、Lp+Ce+Ta组（P<0.05）。

表6 不同添加剂对紫花苜蓿与花生秧混合青贮体外发酵产气量的影响（mL）

2.4 不同添加剂对紫花苜蓿与花生秧混合青贮的体外发酵营养物质消化率的影响

由表7可知，Ta、Lp+Ta、Lp+Ce+Ta组的DMD显著低于CK、Lp、Ce 组（P<0.05）；Ta、Lp+Ta、Ce+Ta、Lp+Ce+Ta组的CPD显著低于CK、Lp、Ce、Lp+Ce组（P<0.05）；Lp+Ta、Ce+Ta、Lp+Ce+Ta组的NDFD分别显著低于Lp、Ce组（P<0.05），其中，Lp组的NDFD最高；CK、Lp、Ce、Ta组的ADFD显著高于其他处理组（P<0.05）。

表7 不同添加剂对紫花苜蓿与花生秧混合青贮体外发酵营养物质消化率的影响（%）

3 讨论

3.1 不同添加剂对紫花苜蓿与花生秧混合青贮样的体外发酵pH和NH3-N的影响

瘤胃pH 的变化与反刍动物瘤胃微生物代谢、瘤胃中营养物质的消化等有关，瘤胃内VFA含量直接影响pH[12]。同时，pH 的变化影响瘤胃微生物菌群的多样性及瘤胃内营养物质的代谢[13]。瘤胃液pH 在5.00～7.50属于正常范围[14]。本试验中，各处理组体外发酵液pH 均在正常范围内，说明添加不同添加剂对瘤胃发酵无不利影响。NH3-N 能够反映蛋白在瘤胃内的降解速率，CP 降解产生NH3-N，瘤胃微生物将其转化为菌体蛋白，高博兰等[15]研究表明反刍动物瘤胃微生物NH3-N适宜含量为6～30 mg/dL，在此范围内表明蛋白质合成与分解处于平衡状态，含量高则表明蛋白在瘤胃内的降解速度快。但超过或低于正常范围均不利于瘤胃内环境的稳定，影响瘤胃内微生物生长。本试验中，各处理组的NH3-H 显著低于CK 组，其中，添加单宁处理组的NH3-H 含量显著降低，说明单宁对NH3-N 的降低有积极作用。这可能是因为减少了CP 在瘤胃内的降解。单宁一方面与蛋白质特异性结合，蛋白酶不能将单宁蛋白质络合物中蛋白质的脱氨基作用减弱，无法将其水解，降低了发酵中NH3-N的含量，另一方面，单宁抑制了瘤胃内革兰氏阳性菌的生长，进一步降低了蛋白质分解和脱氨基的速率。本试验中，各组瘤胃微生物NH3-N含量皆在8～15 mg/dL之间，在反刍动物瘤胃微生物发酵的适宜范围内。相对而言，添加单宁对NH3-N 形成的抑制作用更大，所以在饲草中添加单宁能够有效阻止CP 在瘤胃内的降解，提高CP在体内的利用率。

3.2 不同添加剂对紫花苜蓿与花生秧混合青贮体外发酵VFA含量的影响

VFA 为瘤胃提供70%～80%的能量需求。瘤胃内发酵底物的组成，降解速率及瘤胃内微生物的种类均对VFA 的产生有影响[16]。不同添加剂会影响发酵底物的营养组成和瘤胃微生物，进而对瘤胃发酵产生的VFA造成一定影响。瘤胃VFA含量的变化，会影响瘤胃中氮代谢过程及瘤胃pH[17]。发酵底物富含纤维性碳水化合物利于乙酸发酵，丙酸发酵底物主要是非纤维性碳水化合物。从乙丙比可以推测瘤胃的发酵类型。本试验中，Ce、Lp+Ce、Ce+Ta、Ce+Lp+Ta 组的乙酸/丙酸显著低于对照组，这是可能是因为纤维素酶能够降解发酵底物中的纤维，使得瘤胃对纤维性碳水化合物的利用减少，进而产生的乙酸降低。李岩等[18]研究表明，添加纤维素酶能降低小麦秸秆体外发酵中的乙丙比，与本试验研究结果相似。丁酸能够刺激胃上皮细胞成熟，促进营养物质吸收[19]。Ce、Lp+Ce 组的丁酸含量显著高于其他处理组，表明添加植物乳杆菌能够增加发酵过程中丁酸的含量。加入单宁后，抑制了丁酸的生成，但与对照组和单独添加纤维素酶或植物乳杆菌的处理组相比还是有显著促进作用。相对而言，添加单宁能够降低总酸含量，提升乙丙比。

3.3 不同添加剂对紫花苜蓿与花生秧混合青贮体外发酵产气量的影响

产气量可综合反映瘤胃微生物对青贮的消化利用程度[20]，而且降低产气量，可以预防膨胀病的发生[21]。王满红等[22]研究发现营养物质增加，产甲烷菌增多，产气量也随着菌的增多而随之增加。本试验中，随着发酵时间的增加，产气量呈增长趋势。发酵48 h时，纤维素酶和植物乳杆菌对产气量均无显著影响，不添加单宁时，Lp+Ce 组的产气量最少的，这可能是因为Lp+Ce 组的纤维含量低，CP 含量高。单宁能显著降低瘤胃发酵产气量的。这可能与单宁降低甲烷排放和抑制微生物生长的作用相关。瘤胃在进行消化时会产生挥发性气体，在甲烷菌的作用下，还会产生甲烷。单宁能抑制甲烷菌的活性，从而降低甲烷的排放。丁学智[23]研究单宁对体外瘤胃发酵特性的影响，结果表明单宁酸对甲烷产量的抑制作用随着单宁添加浓度的增加而增强。刘立成等[24]将单宁酸作为饲料补充剂，发现可以显著降低奶牛甲烷产气量。另一方面，单宁可能抑制甲烷菌的生长，降低甲烷产生，从而减少产气量。

3.4 不同添加剂对紫花苜蓿与花生秧混合青贮体外发酵营养物质消化率的影响

饲料的养分被机体消化吸收的程度可通过瘤胃DM 消化率衡量,其消化率与利用率呈正相关[25]，饲料的消化程度可通过中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维降解率衡量[26]。牧草消化程度越高，NDF 瘤胃降解率越高，说明瘤胃发酵状态越好[27]。在本试验中，单独添加植物乳杆菌组的DM 和NDF 消化率最高，这可能是因为植物乳杆菌能改变青贮中纤维素的总体结构，在瘤胃中继续水解剩余的纤维素，进一步提高纤维降解率，进而有效增加了青贮饲粮的DMD 和NDFD。添加纤维素酶对NDFD 无显著影响，这可能是因为易消化的NDF 被溶解，但NDF 的潜在消化率并未增加[28]。由于NDF 在饲料中的含量和消化率决定了有机物的消化率，所以纤维素酶对NDF含量的最终影响可能会改变最终青贮的能值[29]。本试验中,添加植物乳杆菌和纤维素酶对CP 消化率没有显著影响。添加单宁后，各营养成分的瘤胃降解率均有一定的降低，对CP消化率的影响显著。饲料中蛋白质大多以含氮化合物的形式存在于细胞内的组织液中，因此饲草细胞壁的纤维结构也会影响蛋白质的降解程度[30]。CP 的瘤胃降解率也受蛋白质在瘤胃中滞留的时间、组分以及含量等因素的影响[31]。Satter[32]还特别指出饲料粗蛋白降解率受饲料本身的特性的影响比较大，粗蛋白的迅速降解部分、粗蛋白的慢降解部分以及粗蛋白的不易降解部分在各种饲料中的比重不同。添加单宁后，各组的CP 消化率均显著降低，这可能与发酵底物中结合蛋白质含量（PC）有关，添加单宁后，单宁与蛋白质结合形成络合物，导致PC 含量增加，该部分蛋白不能在瘤胃内降解，所以，CP消化率因此降低。

4 结论

乳酸菌、纤维素酶和单宁对苜蓿与花生秧混合青贮后瘤胃降解特性和营养物质降解率均有不同程度的影响。综合评价来看，单宁对苜蓿与花生秧混合青贮饲料体外发酵有抑制作用，添加植物乳杆菌和纤维素酶能够缓解单宁的抑制作用。