复合益生菌对绍兴鸭血清生化、盲肠短链脂肪酸及微生物区系的影响

■ 卢丽枝 雷丽莉 章岳军 高秋玲 吴永峰 吴忠才 沈水宝 张淑芳*

（1.广西壮族自治区畜牧站，广西南宁 530022；2.广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530004；3.英杰（长沙）生物科技有限公司，湖南长沙 410000；4.广西桂柳牧业集团，广西桂林 541000）

我国农业农村部公告第194 号规定，自2020 年7 月1 日起停止生产使用含有生长类药物饲料添加剂（中药类除外）的商品饲料。自此，我国正式迎来了饲料无抗时代[1]。但随着禁抗时代的到来，我国养殖业面临的新问题是畜禽抵抗力降低，患病率有所增加，生产效益降低，给养殖场（户）带来不小的经济损失，因此寻找新的替抗产品势在必行。益生菌作为一种活的微生物，当宿主体内积累到一定剂量时可以起到增强机体免疫力，减少肠道疾病的效果[2]。益生菌被广泛应用在食品、医药和农业生产，通过定植在动物体内调节宿主黏膜与免疫系统，调节肠道菌群，促进营养物质吸收保持肠道健康[3]。因此，益生菌对养殖动物的影响研究也受到广泛关注。阮胜钢等[4]研究发现，在雏鸭饲料中添加枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的复合益生菌，增加了雏鸭的免疫能力，并显著提高了28 日龄雏鸭的平均日增重；Song等[5]研究发现，在热应激的肉鸡饲粮中添加由植物乳酸杆菌、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌组成的复合益生菌可有效增加小肠中乳酸杆菌等有益菌群定植。鸭具有耐寒、耐粗饲、免疫力强，早期生长较快，但是由于现代集约化养殖条件，养殖密度大、饮水条件差和冷热应激较大，造成鸭容易出现肠道问题[6]。研究旨在探究嗜酸乳杆菌、屎肠球菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌组成的复合益生菌在不同添加量下对绍兴鸭血清生化、盲肠短链脂肪酸及微生物区系的影响，为益生菌在改善鸭肠道健康以及免疫方面提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用复合益生菌购自英杰（长沙）生物科技有限公司提供，主要有效成分为嗜酸乳杆菌1×109CFU/g、屎肠球菌1×109CFU/g、枯草芽孢杆菌1×109CFU/g、地衣芽孢杆菌1×109CFU/g。试验所用试剂盒均购自南京建成生物工程研究所有限公司。试验动物和养殖场地均由广西桂柳牧业集团提供。

1.2 试验设计与饲养管理

试验采用单因素完全随机设计，选取同一批次健康、体重相近1日龄的绍兴鸭1 200只，随机分4组，每组5个重复，每个重复60只。对照组饲喂基础饲粮，A组在基础饲粮基础上添加100 mg/kg 复合益生菌，B 组在基础饲粮基础上添加200 mg/kg 复合益生菌，C 组在基础饲粮基础上添加300 mg/kg 复合益生菌。预试期3 d，正试期30 d。饲养试验在广西桂柳牧业集团养殖场进行，均采用网上平养方式，自由采食和饮水，免疫程序按照鸭场现行常规免疫进行。

1.3 基础饲粮

基础饲粮为玉米-豆粕型饲粮，参考NY/T 827—2004《绍兴鸭饲养技术规程》[7]并结合试验鸭场企业标准设计。试验全期饲喂颗粒料，基础饲粮组成以及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平（风干基础）

1.4 样品采集

于正试期第30 天，试验鸭禁食12 h，正常饮水，每个重复随机选取1 只绍兴鸭进行翅下静脉采血，3 000 r/min离心15 min后，用移液枪将血清移到1.5 mL离心管中，-20 ℃保存，用于测定血清生化指标和免疫指标；随后进行安乐死屠宰，取盲肠内容物，-80 ℃保存，用于测定盲肠短链脂肪酸和微生物区系。

1.5 检测指标与方法

1.5.1 生长性能

分别在试验开始和结束当天以重复为单位对其进行空腹称重，用于计算平均日增重；以每组每个重复为单位记录试验鸭的投料量以及剩余料量，用于计算平均日采食量和料重比。

平均日增重（g）=（末体重-初体重）/试验天数

平均日采食量（g）=（投料量-剩余料量）/试验天数/试验鸭数

料重比=平均日采食量/平均日增重

1.5.2 血清生化指标

采用购自南京建成生物工程研究所有限公司的ELISA 试剂盒，使用酶标仪测定血清中总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、葡萄糖（GLU）、尿素氮（BUN）、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）等血清生化指标以及血清免疫球蛋白M、A、G（IgM、IgA、IgG）指标含量，严格按照试剂盒说明书操作。

1.5.3 盲肠短链脂肪酸

测定盲肠内容物中短链脂肪酸（SCFAs）的含量；采用直接进样的气相色谱法和内标定量能计算法测定分析盲肠内容物中短链脂肪酸的含量。

1.5.4 盲肠微生物区系

试验结束当天，在无菌的操作下取盲肠内容物1.5～2.0 mL装入冻存管，-80 ℃保存，然后干冰送往上海生物医药科技有限公司委托进行16S rRNA V3～V4微生物区系检测。

1.6 数据统计与分析

试验数据经Excel 简单整理后，使用SPSS 23.0 软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA），并以Duncan’s法进行多重比较。结果以“平均数±标准误”表示，以P<0.05 为差异显著，P<0.01 为差异极显著判断标准。

2 结果与分析

2.1 复合益生菌对绍兴鸭生长性能的影响

由表2 可知，与对照组相比，A、B、C 组绍兴鸭的平均日增重和平均日采食量差异不显著（P>0.05），但3个试验组平均日增重分别增加2.4%、5.3%、4.6%，平均日采食量分别增加2.0%、2.5%、3.1%；A、B、C 组绍兴鸭的料重比均低于对照组，其中B、C 组显著低于对照组（P<0.05），A、B、C组分别降低0.5%、4.2%、1.6%。

表2 复合益生菌对绍兴鸭生长性能的影响

2.2 复合益生菌对绍兴鸭血清生化指标的影响

由表3 可知，与对照组相比，A、B、C 组绍兴鸭总蛋白、白蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、葡萄糖、尿素氮、三酰甘油、总胆固醇等血清生化指标差异不显著（P>0.05）；A、B、C 组绍兴鸭的IgM 和IgA含量极显著提高（P<0.01），但各试验组中IgG 含量与对照组差异不显著（P>0.05）。

表3 复合益生菌对绍兴鸭血清生化指标的影响

2.3 复合益生菌对绍兴鸭盲肠短链脂肪酸含量的影响

由表4可知，与对照组相比，A、B、C组绍兴鸭盲肠乙酸含量显著提高（P<0.05），分别增加14.3%、7.14%；A、B、C组绍兴鸭盲肠丙酸、丁酸含量与对照组差异不显著（P>0.05）；A组绍兴鸭盲肠异戊酸含量显著提高（P<0.05），盲肠异戊酸含量显著降低50%（P<0.05）。

表4 复合益生菌对绍兴鸭盲肠短链脂肪酸含量的影响（mmol/g）

2.4 复合益生菌对绍兴鸭盲肠微生物区系的影响

2.4.1 复合益生菌对绍兴鸭盲肠微生物区系的OTU分析

由表5和图1可知，对照组的OTU数量为1 046个，A、B、C 组分别为988、971、1 058 个；其中对照组特有OTU 数量为66 个，A 组特有OTU 数量为65 个，B 组特有OTU数量为33个，C组特有OUT数量为34个。

图1 复合益生菌对绍兴鸭盲肠OTU数量韦恩图

表5 复合益生菌对绍兴鸭盲肠微生物区系OTU数量的影响

2.4.2 复合益生菌对绍兴鸭盲肠微生物区系门水平物种分布的影响

由图2 可知，绍兴鸭盲肠微生物门水平物种组成相对丰度排行前7 位的微生物。各组盲肠菌群组成主要由拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门（Actinobacteriota）、脱硫菌门、延叶杆菌门、螺旋藻门等组成。其中差异菌门为拟杆菌门和厚壁菌门。拟杆菌门占整个菌群的比例，对照、A、B、C 组分别为46.4%、56.9%、47.1%、51.1%；厚壁菌门占整个菌群比例，对照、A、B、C 组分别为47.9%、38.2%、40.1%、42.2%。从图3 可以看出，与对照组相比，各试验组差异菌门拟杆菌门和厚壁菌门相对丰度均差异显著（P<0.05）。

图2 门水平上物种分布

2.4.3 复合益生菌对绍兴鸭盲肠微生物区系属水平物种分布的影响

由图4 可知，绍兴鸭盲肠微生物属水平物种组成相对丰度排名前34 位微生物，其中对照、A、B、C 组总和占总菌属的比例分别是78.5%、84.2%、79.7%、80.2%，优势菌属拟杆菌属占总菌属比例分别为25.9%、38.2%、40.1%、42.2%。其中差异菌群为瘤胃球菌属和拉氏鳞毛蕨属，从图5 可以看出，与对照组相比，各试验组差异菌属瘤胃球菌属和拉氏鳞毛蕨属差异显著（P<0.05）。

图5 属水平差异菌群相对丰度

3 讨论

3.1 复合益生菌对绍兴鸭生长性能的影响

注：Bacteroides，拟杆菌属；Prevotellaceae_Ga6A1_group，普雷沃氏菌Ga6A1；unclassified_f＿Lachnospiraceae，未分类的毛螺菌属；Prevotella，普氏菌属；Faecalibacterium，粪杆菌属；Rikenellaceac_RC9_gut_group，理研菌RC9；unclassified_f＿Oscillospiraceae，未分类的颤螺旋菌属；Parabacteroides，青春双歧杆菌属；Prevotellaceae_UCG-001，普雷沃氏菌属UCG001；norank_f＿norank_o＿Clostridia_UCG-014，梭状芽孢杆菌属UCG014；UCG-005，拟普雷沃氏菌属UCG-005； Prevotellaceae_NK3B31_group，普雷沃氏菌科NK3B31；unclassified_o＿Bacteroidales，未分类的拟杆菌属；Shutteworthia，梭状花属；Ruminococcus_torques＿group，瘤胃球菌属；norank_f＿Eubacterium_coprostanoligenes_group，未分类的粪真杆菌属；norank_f＿Prevotellaceae，未分类的普雷沃氏菌属；Lachnoclostridium，拉氏鳞毛蕨属；Subdoligranulum，罕见小球菌属；norank_f＿Oscillospiraceae，颤螺旋菌科；Butyricicoccus，丁酸杆菌属；Mucispirillum，黏液螺旋菌属；Desulfovibrio，脱硫弧菌属；Alistipes，另枝菌属；Romboutsia，郎布特西亚属；norank_f＿norank_o＿Bacteroidales，未分类的拟杆菌目；Oribacterium，假丁酸弧菌属；Megamonas，巨单胞菌属；Christensenellaceae_R-7_group，克里斯滕森菌科R-7；Treponema，密螺旋体属；others，其他。

畜禽生长发育状况是畜禽养殖场（户）衡量生产水平和经济效益的重要指标[8]。李小芬等[9]研究表明，在饲料中添加乳酸杆菌、纳豆芽孢杆菌均可以提高樱桃谷肉鸭的平均日增重和终末体重，降低料重比，从而增加经济效益；刘晓琳等[10]研究表明，在日粮中添加0.05%枯草芽孢杆菌可提高樱桃谷鸭的育成率，降低料重比。本研究结果与前人研究结果相同，饲粮中添加复合益生菌可显著降低绍兴鸭的料重比，且添加量200 mg/kg效果较好。

3.2 复合益生菌对绍兴鸭血清生化指标的影响

动物的血液指标反映动物在其内外部环境中营养配制的生理变化[11]。血清中白蛋白是最丰富的血浆蛋白，约占血清蛋白的55%～56%，其中白蛋白主要与其合成和分解代谢有关，并起到维持血液渗透压的作用，球蛋白则是血清免疫球蛋白的主要成分，主要参与动物机体营养运输以及免疫等功能，共同参与机体的代谢和内环境的稳定。总蛋白可以为动物生长提供良好的营养物质，其含量也是反映动物机体营养状况的指标之一[12-13]。许运岑[14]研究表明，枯草芽孢杆菌可以显著提高AA肉鸡血清中的总蛋白和球蛋白含量，但对血清中白蛋白含量影响不大。蒋山翊等[15]研究表明，0.02%枯草芽孢杆菌可以显著提高白羽肉鸡血清中白蛋白、总蛋白和球蛋白的含量。刘小龙等[16]研究表明，添加单独或者联合使用抗菌肽或合生素（植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和壳寡糖）可显著提高AA 肉鸡血清中白蛋白和总蛋白含量。本研究结果与前人研究结果相悖，饲粮中添加复合益生菌对绍兴鸭血清中白蛋白、总蛋白和球蛋白均无显著影响，其可能原因是益生菌菌株种类以及含量不同，或者是试验动物种类以及试验环境差异影响。

益生菌对动物机体有免疫调节作用，可促进IgA发挥免疫调节作用，从而增强机体抵御入侵病原体的免疫作用[17]。Tana 等[18]研究表明，添加1%的乳杆菌复合物可显著提高肉仔鸡血清中IgG 和IgA 的含量。陈辉[19]研究表明，添加0.4%、0.6%、0.8%的复合益生菌可显著提高肉仔鸡21 日龄和42 日龄血清中IgG 的含量。本研究结果与前人研究结果相同，添加复合益生菌可极显著提高绍兴鸭血清中IgM 和IgA 的水平，但是对血清中IgG 含量的影响不大，但相比对照组有增加趋势，在配合饲粮中添加量为200 mg/kg 效果较好。

3.3 复合益生菌对绍兴鸭盲肠短链脂肪酸含量的影响

肠道屏障是抵抗肠道中病原微生物和有毒有害气体的第一道防线，对维持机体发挥正常功能至关重要。短链脂肪酸是肠道微生物代谢产物之一，对维持肠道健康发挥至关重要的作用[20]。短链脂肪酸是由肠道菌群通过糖酵解和磷酸戊糖途径降解不易消化的膳食纤维产生的代谢产物，短链脂肪酸是由1～6 个碳原子的有机脂肪酸组成，主要包括乙酸、丙酸和丁酸，其中乙酸是肠道中含量最丰富的短链脂肪酸[21-22]。若短链脂肪酸浓度过高可引起动物食欲减退、免疫力降低，导致发生群体性呼吸道疾病，严重时导致呼吸困难肺水肿和充血等症状[23]。本研究表明，饲粮中添加复合益生菌显著增加肠道中乙酸的含量，其中复合益生菌添加100 mg/kg 时绍兴鸭盲肠异戊酸含量较对照组差异显著，且盲肠异戊酸较对照组含量降低50%。由此可见，饲粮中添加复合益生菌可增加盲肠乙酸含量而降低盲肠异戊酸的含量。

3.4 复合益生菌对绍兴鸭盲肠微生物区系的影响

盲肠微生物群在动物健康和生产性能中起着关键作用，影响营养物质的消化吸收，并有助于预防有害病原体的定植。大量研究表明，家禽盲肠中拟杆菌门、厚壁菌门和放线菌门为高相对丰度菌门[24-26]，而本研究结果与前人研究结果相同。李宁等[27]研究表明，益生菌通过竞争、抑制肠道内有害细菌，增加有益菌从而稳定肠道菌群。盲肠对动物机体糖代谢和氮代谢起重要作用，食糜进入盲肠可被肠道中的微生物吸收利用，其中发现拟杆菌门具有促进营养物质吸收作用，厚壁菌门具有抑制营养物质吸收作用，拟杆菌门降低或厚壁菌门增加都有助于脂肪的吸收和积累[28]，因此拟杆菌门和厚壁菌门在盲肠门水平分析中占比较高。研究发现，厚壁菌门和拟杆菌门参与肠道中短链脂肪酸代谢，其中厚壁菌门参与丙酸和丁酸合成，而拟杆菌门主要参与丙酸合成[29]，进而参与盲肠的代谢。张孟阳等[30]研究表明，在56 日龄仔鸡肠道中优势菌门为厚壁菌门（48.61%）和拟杆菌门（31.10%）。赵彦光等[31]研究表明，饲粮中添加复合益生菌极显著提高门水平上拟杆菌门的相对丰度。本试验基于门水平研究结果表明，肠道菌群具有多样性丰富的特点，拟杆菌门、厚壁菌门为两个丰度最高的菌门，同时也是差异最大的菌门，与对照组相比各试验组拟杆菌门占比均高于对照组，厚壁菌门均低于对照组。郝永胜等[32]研究表明，拟杆菌属是鸭盲肠主要菌属，是短链脂肪酸主要生产者，主要影响盲肠菌群和盲肠发育。基于属水平的研究结果表明，优势菌属是拟杆菌属，差异菌属为瘤胃菌属和拉氏鳞毛蕨属，本试验研究结果与前人研究结果相同。说明添加复合益生菌对盲肠门水平和属水平上的拟杆菌有增加作用。

4 结论

添加复合益生菌可降低绍兴鸭的料重比，同时增加绍兴鸭血清中IgM 和IgA 含量，且在配合饲料中添加量200 mg/kg 较好。添加复合益生菌可增加盲肠中乙酸含量，增加拟杆菌门和拟杆菌属的相对丰度，同时降低厚壁菌门的相对丰度，稳定肠道菌群，且在配合饲粮中添加量100 mg/kg较好。