运动通过降低氧化Glu毒作用改善PD运动功能障碍研究进展

周文辉 李刚强

(吉首大学 体育科学学院,湖南 吉首 416000)

帕金森病(parkinson's disease,PD)是一种仅次于阿尔茨海默病的第二大常见的神经系统变性疾病,老年人多见,平均发病年龄为60岁左右[1-2]。据目前数据统计,2015年全球有690万PD患者,预计到2040年这一数字将为1420万[3]。PD患者表现出认知和包括平衡不稳、步态障碍、运动迟缓、静止性震颤和肌肉僵直等在内的运动功能障碍[4]。PD出现这些运动功能障碍是由中脑黑质致密部(substantia nigra pars compacta,SNpc)多巴胺(dopamine,DA)能神经元变性丢失导致随后向基底神经节(Basal ganglia,BG)纹状体释放的DA大量减少所致[5]。

谷氨酸(Glutamate,Glu)是哺乳动物大脑中枢神经系统(CNS)中极为重要的兴奋性神经递质,参与各种生理功能和代谢过程[6]。而DA是一种抑制性神经递质,正常情况下可将丘脑底核(subthal amic nucleus,STN)的兴奋状态维持在基础水平。在PD病例中,由于DA神经元变性丢失,皮质-纹状体Glu通路过度激活,导致突触前Glu的过度合成或释放以及Glu再摄取的减少导致突触间隙高浓度的Glu,除了导致受体介导的兴奋性毒性外,还会抑制胱氨酸摄取,导致谷胱甘肽(glutathione,GSH)缺乏,引发非受体介导的氧化Glu毒性[7]。突触后缺乏Glu受体的神经元在这一过程中也被杀死,氧化Glu毒性可能比兴奋性毒性造成更多的损伤。所以,阻止突触前Glu的过度释放或者抑制Glu发挥功能效应,能够达到降低氧化Glu毒性作用的目标。而这可以通过调节BG区代谢型Glu受体(metabotropic glutamate receptors,mGluRs)的表达水平来实现[8-9]。运动疗法作为另一种选择正在引起人们的关注,作为一种辅助的治疗手段,在PD的临床康复中已经得到了广泛应用。流行病学研究和临床观察表明,体力活动和运动可以降低PD的发病风险以及改善PD相关行为功能障碍。动物实验结果证明,不同形式的运动干预可以通过降低BG区的氧化损伤,改善PD相关行为/运动功能障碍。提示运动改善PD相关行为功能障碍的神经生物学机制可能与降低氧化Glu毒性作用密切相关。本文就目前有关运动降低氧化Glu毒性作用改善PD相关行为/运动功能障碍的研究进行综述,为运动干预改善PD相关行为功能障碍的可能神经生物学机制提供一定的理论依据。

1 氧化Glu毒性

1989年,Murphy等报道在N18-RE-105神经母细胞瘤X视网膜细胞系中,Glu通过抑制胱氨酸/Glu逆向转运体(又称System Xc-)的胱氨酸输入[10],导致重要的抗氧化剂GSH耗竭和氧化应激,从而诱导Ca2+依赖性细胞死亡[11]。这种类型的细胞毒性被命名为氧化Glu毒性,并且已在海马细胞系HT22(海马细胞系HT4的Glu敏感性亚克隆)中进行了广泛研究[12]。System Xc-由重链4F2hc(CD98/SLC3A2基因)和轻链xCT(SLC7A11基因)组成,通过二硫键连接;xCT蛋白的轻链和组蛋白乙酰转移酶(heterodimeric amino acid transporter,HAT)明显均匀,HAT是一个氨基酸转运蛋白家族,由轻链和重链通过二硫键连接[13]。xCT包含12个跨膜结构域,N-和C-末端位于细胞内,胞内环2和环3之间有一个折返结构[14],该结构与其他HAT轻链相同。4F2hc是一种II型膜蛋白,具有细胞质N末端、一个跨膜结构域和一个体积较大的细胞外N-糖基化C末端结构域或胞外域[15]。xCT和4F2hc均在脑中高度表达[16]。然而,有实验证据表明,在System Xc-的活性调节过程当中,xCT表达的转录调控比4F2hc表达更为重要,4F2hc的表达对System Xc-的活性影响不大[13]。System Xc-是一种钠和氯化物依赖性氨基酸逆向转运蛋白(以xCT为特定亚基)。其以1:1的比例向相反方向将非必需含硫氨基酸半胱氨酸阴离子化合物转运至细胞和Glu中,此外它还参与GSH合成以及转运Glu,调节细胞外Glu浓度[17,18]。由于胱氨酸快速还原为半胱氨酸在细胞质中非常罕见,而细胞中Glu浓度远高于细胞外液[19]。细胞通过System Xc-摄取的胱氨酸迅速还原为半胱氨酸,后者掺入蛋白质和GSH中[20]。半胱氨酸是抗氧化剂GSH合成的限速前体,细胞内的GSH水平受System Xc-活性的调节[21]。激活System Xc-的机制与刺激mGluR2/3有关,胱氨酸可引起System Xc-介导的Glu外流,激活突触前mGluR2/3,从而抑制囊泡内Glu进入突触间隙;突触后,System Xc-释放的Glu激活代谢型Glu受体5(mGluR5)[10]。激活System Xc-间接调节突触Glu释放的事实,说明System Xc-有调节突触可塑性的可能性。

氧化Glu毒性与Glu兴奋性毒性不同,后者细胞外Glu浓度增加过度刺激离子型谷氨酸受体(ionotropic glutamate receptors,iGluRs),从而导致大量Ca2+内流和神经元细胞死亡[22]。而在HT22中氧化Glu毒性发挥作用的细胞死亡途径如下:1)氧化Glu毒性的第一步是通过System Xc-抑制胱氨酸摄取导致细胞GSH缺乏,尽管已经发现一些细胞可通过胱硫醚β-裂解酶合成胱硫醚,但神经元通常不表达该酶。因此,主要依赖于细胞外胱氨酸。当胱氨酸吸收被阻断时,细胞内GSH消耗远快于蛋白质合成[23]。此外,System Xc-的抑制,ROS的后续蓄积和GSH水平的降低都会导致细胞的抗氧化防御失效,最终可能会导致铁下垂[24,25]。当GSH浓度降至20%以下时(Glu暴露后约6小时),氧化Glu毒性发生第二步:2)通过线粒体复合物I(NADH脱氢酶)活性连续生成自由基呈指数增加。此时,脂质氧化酶12/15-脂氧合酶(12/15-lipoxygenase,12/15-LOX)的活化产生12/15-羟基二十碳四烯酸[26]。12/15-LOX可直接损伤线粒体,导致线粒体去极化,增加ROS的产生[27]。12-LOX产生的类花生酸是可溶性鸟苷酸环化酶(soluble guanylate cyclase,sGC)的激活剂,可增加细胞内环磷酸鸟苷(cyclic guanosinc monophosphate,cGMP),导致钙通道打开,引发大量Ca2+内流[28]。最后,氧化Glu毒性诱导Glu氧化约10-12小时,此时ROS和细胞内钙水平均达到最大值,凋亡诱导因子(AIF)从线粒体转位到细胞核,几分钟内发生细胞内诱导核固缩和半胱天冬酶非依赖性细胞死亡(图1)[29]。

图1 氧化Glu毒性的细胞死亡途径(修改自[11])

综上,氧化Glu毒性导致神经元细胞死亡的过程中System Xc-发挥了关键性作用,通过mGluR2/3对System Xc-活性的调节可能是降低氧化Glu毒性的一个有效手段。此外,线粒体复合物I活性的改变以及sGC的激活导致cGMP的增加均与氧化Glu毒性的产生和发展息息相关。

2 氧化Glu毒性与PD

近些年来,关于氧化应激、神经炎症、线粒体功能障碍和兴奋性毒性等与PD研究的相关报道逐渐增多,而BG区纹状体细胞外Glu浓度异常升高所引起的氧化Glu毒性与PD的相关研究较少,仅有少数报道。David等[30]提出,PD兴奋性毒性级联反应可分为三部分,其中第二部分涉及20-30%的细胞死亡途径,具有氧化Glu毒性特征,因为其可被维生素E、I组代谢型受体激动剂、半胱天冬酶抑制剂、细胞外胱氨酸升高和细胞外Glu清除特异性抑制。在PD状态下,当突触前膜释放过多的Glu或Glu的再摄取功能受损时,细胞外Glu浓度增加,活化的小胶质细胞和反应性星形胶质细胞释放大量Glu[31]。过量的Glu作用于System Xc-,抑制胱氨酸转运到细胞内,一方面导致GSH合成降低和大脑清除过氧化物的能力受损;另一方面导致System Xc-释放的Glu减少,对mGluR2/3的激活减弱,导致突触前Glu的释放增加,从而对神经元细胞产生氧化损伤[32]。Baker等[33]研究表明,在大鼠伏隔核中System Xc-是细胞外Glu的主要来源,System Xc-参与PD的发病机制可能是双重的:活性增加可保护大脑免受氧化应激,同时,Glu释放增加可导致兴奋性毒性。此外,有大量的体外研究和动物模型实验证明,敲除或者抑制System Xc-活性,能够对中枢神经系统疾病(包括PD)起到很好的治疗作用。Battaglia等[34]研究发现,6-OHDA注射到前脑内侧束后3周,半帕金森大鼠纹状体xCT蛋白水平发生同侧增加。在使用xCT-/-小鼠的随访研究显示,System Xc-缺陷小鼠黑质DA能神经元受到高度保护,防止6-OHDA诱导的神经元变性[35]。具体而言,与注射6-OHDA的野生型小鼠相比,纹状体注射6-OHDA的xCT-/-小鼠SNpc的DA能神经元受到显著保护。xCT-/-小鼠细胞外Glu水平降低,加上6-OHDA模型中DA能神经元的存活率增加,表明System Xc-可能是PD治疗中一个非常有前景的药理学靶点。

值得注意的是,在氧化Glu毒性中因线粒体复合物I活性改变而自由基增加导致产生的ROS本身并不杀死细胞,而是有助于线粒体功能障碍,从而进一步增加ROS和氧化应激的形成,最终导致神经元细胞死亡[10]。由此可见,细胞内大量ROS的积累不足以引起死亡,但它是细胞死亡过程中的必要步骤。与这一观点一致的是,即使在ROS水平升高的情况下,阻断ROS积累下游信号通路的化合物也可以起到神经保护作用[36,37]。这些ROS的主要来源是线粒体电子传输链的复合物I。此外,这些ROS的重要性得到了实验证实,线粒体氧化磷酸化解偶联剂和其他线粒体抑制剂均可保护神经细胞免受氧化Glu毒性[23]。以上研究事实表明,线粒体复合物I产生的ROS不会直接杀死细胞,但ROS的大量积累会导致下游信号通路的激活,间接诱导神经元细胞损伤或死亡。因此,线粒体复合物I可能是降低PD氧化Glu毒性的一个重要靶点。据报告,PD患者的黑质线粒体呼吸电子传递链复合物I活性以及血小板和淋巴细胞轻度缺乏,表明PD患者的复合物I活性受到系统性抑制[38]。有证据显示,复合物I受到抑制会导致生物能量失效,导致ATP消耗和随后的细胞死亡[39]。Kuter等[40]研究发现,在6-OHDA毒性的啮齿类动物PD模型中,神经元变性伴随着几乎所有形式的超级复合物中复合物I蛋白水平和活性降低以及纹状体超级复合物中复合物IV活性降低。这些观察结果与从PD患者成纤维细胞纯化的线粒体中超级复合物的复合物I和IV的解体和丢失一致。而这些可能会导致细胞内Ca2+水平升高,氧化应激增强,最终损伤神经元并引起其死亡。近期Kuan等[41]研究表明,一种新的非编码p137 RNA(来源于人巨细胞病毒β 2.7转录本),可以通过保护线粒体复合物I活性,在体外和PD模型动物中预防和挽救DA能神经元细胞死亡。

氧化Glu毒性中12-LOX活化产生12/15-羟基二十碳四烯酸,导致sGC被激活。sGC是cGMP通路中的一种重要酶蛋白,脱轨时可能是PD或PD加重的致病因素[42]。sGC-cGMP通路是由三磷酸鸟苷(Guanosine triphosphate,GTP)合成cGMP的生理过程,导致蛋白激酶(protein kinase,PK)活化,引起细胞水平的各种生理变化[43]。由于PK依赖离子通道的激活,刺激sGC可增加细胞Ca2+水平[44]。此外,当sGC受到过度刺激时,导致cGMP生成过多以及激活蛋白激酶G,即cGMP依赖性蛋白激酶(cGMP-dependent protein kinase,PKG),进而导致Glu活性过高,会引起Glu毒性[45]。而这种Glu毒性可能会导致细胞产生大量ROS,导致DA能神经元细胞凋亡,引发动物或人类的异常运动行为[46,47]。近期研究发现,使用sGC抑制剂可能阻止PD的进展以及减弱纹状体神经元的凋亡,如sGC抑制剂1H-2和恶二唑-3-a喹喔啉-1-酮可改善MPTP和6-OHDA模型小鼠的皮质纹状体突触传递和运动行为[48]。

3 运动与氧化Glu毒性和PD防治

PD黑质-纹状体通路去DA能神经支配导致BG Glu能传递异常增高,导致DA能神经元进一步丢失以及PD进行性发展,最终导致PD相关行为功能障碍的进一步恶化。有关通过运动降低氧化Glu毒性作用改善PD相关行为/运动功能障碍的研究还未见报道,而对PD模型动物的相关研究也还处于发展阶段,仅有少数报道。Chuang等[49]研究发现,四周的跑台运动干预可使6-OHDA诱导的单侧PD模型大鼠氧化应激减弱,改善了DA能神经元的活力,表现为线粒体复合物I蛋白表达水平升高,复合物II、III、IV表达水平降低,提高了步态参数在最大面积、挥杆速度、步幅和姿势阶段方面的表现以及降低了甲基苯丙胺引起的旋转。Ferreira等[50]研究表明,四周的跑台运动干预可使6-OHDA诱导的单侧PD模型大鼠线粒体复合物I蛋白水平表达升高,各组黑质复合物Ⅱ-V和纹状体复合物Ⅰ-V水平均无变化,步态参数数据均得到显著性改善以及阿扑吗啡诱导的旋转圈数显著减少。综上,运动可能通过调节线粒体复合物I表达水平,降低氧化Glu毒性作用改善PD相关行为/运动功能障碍。

Shi等[51]研究表明,4周跑台运动干预能使6-OHDA诱导的偏侧损毁PD模型大鼠纹状体细胞外Glu水平显著降低,纹状体mGluR2/3蛋白表达水平显著升高,mGluR1/5蛋白表达水平显著下降,自主错步行为测试结果较PD组有显著性改善。Chen等[52]研究发现,跑台运动干预可使6-OHDA偏侧损毁PD模型大鼠纹状体胞外Glu 浓度显著降低,mGluR3 mRNA和mGluR2/3蛋白的表达水平显著升高,大鼠的自主活动和运动协调能力显著改善。综上,运动可能通过调节BG区mGluR2/3表达水平,降低氧化Glu毒性作用改善PD相关行为/运动功能障碍。而运动干预对其他Glu受体(glutamate receptor,GluR)不同亚基、亚单位的影响是怎么样的,不同类型和不同强度的运动干预对线粒体复合物I和mGluR2/3的影响又是怎么样的,这对于探究运动改善PD相关行为功能障碍的可能神经生物学分子机制是十分重要的,在未来还需要进一步的深入探索。

4 运动通过氧化Glu毒性防治PD的胞内可能分子机制

在PD状态下,纹状体神经元胞外Glu浓度增加。细胞外环境中的Glu过度积累通过System Xc-抑制胱氨酸摄取,GSH水平呈时间依赖性下降。同时,通过System Xc-释放的Glu减少,导致对定位于皮层纹状体突触前末梢mGlu2/3的激活减弱,诱导突触前Glu释放增多。当GSH水平低于20%时,ROS开始呈指数增加;Glu长时间暴露于细胞外导致线粒体复合物I活性受到抑制,这时氧自由基呈指数增长,引起ROS大量增加。GSH消耗还会导致12/15-LOX活化,活化的12/15-LOX直接损伤线粒体,线粒体去极化,进一步增加ROS产生(ROS主要来自于线粒体复合物I)。12/15-LOX活化还会产生12/15-羟基二十碳四烯酸,这类花生酸可激活sGC,然后生成cGMP和激活PKG。由于PKG的激活使Ca2+通道、促iGluRs磷酸化作用增强,诱导大量Ca2+内流[46]。ROS的持续增加以及Ca2+水平的不断升高,进而神经元产生氧化Glu毒性损伤,导致DA能神经元的凋亡,最终破坏BG区的正常功能而出现PD相关行为功能障碍。

在轴突中,Glu储存在突触囊泡中。mGlu2/3定位于皮层-纹状体突触前末梢,它们与System Xc-发生作用,激活或者上调mGlu2/3会下调System Xc-的活性[10]。该受体激活后减少环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)的生成和抑制蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)活性,导致细胞膜钙通道的磷酸化受到抑制,阻止细胞外Ca2+内流,从而使囊泡内释放出的Glu水平降低[53]。综上,运动干预一方面可能通过上调线粒体复合物I蛋白表达水平,减轻氧化损伤,降低氧化Glu毒性作用;一方面可能通过上调定位于皮层纹状体突触前末梢mGlu2/3的mRNA和蛋白表达水平,降低PD纹状体神经元胞外Glu浓度,从而降低氧化Glu毒性作用,最终改善PD相关行为/运动功能障碍。

5 结论与展望

PD已成为世界日益关注的热点问题。运动干预可以改善PD患者和模型动物的相关行为功能障碍或延缓症状的发展。这种积极的影响效应可能是通过上调BG区mGlu2/3mRNA和蛋白表达水平以及线粒体复合物I蛋白表达水平,降低PD氧化Glu毒性作用来实现的。BG区纹状体Glu能系统的信号传导与PD的发生和进展密切相关,为了能深入剖析运动干预改善PD相关行为功能障碍的可能神经生物学分子机制,在未来还需要更加深入的研究BG区各种神经元细胞、受体,酶等之间的相互作用关系,这对PD运动防治的研究具有非常潜在的价值。