3 种植物浸提液对铜绿微囊藻化感效应研究

蔡鸿娇，冯少贻，林 茂，潘承丽，李忠琴，钱瑞芳

(1.集美大学水产学院，厦门市渔用药物工程技术研究中心，福建 厦门 361021；2.惠安县鑫海水产科技有限公司，福建 泉州 362131)

铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)为常见引发水华的蓝藻之一。蓝藻的大量繁殖争夺水体溶氧，导致水生动物大量死亡，水体恶臭。浮藻繁殖旺盛、覆盖水面从而阻碍水生植物的光合作用，造成水生植物逐渐死亡(李祎等，2022)；蓝藻死亡后释放有毒物质——蓝藻毒素，会对水生动物产生危害，因此防治蓝藻水华、维持生态平衡刻不容缓。

常见的蓝藻防治方法分为物理、化学和生物法3类。物理除藻如超声波控藻、遮光抑藻，虽然环保经济，但是耗费时间长、野外操作困难而且花费大；化学药剂除藻虽然见效快，但是化学药剂残留会导致生态安全风险，其应用受到限制；生物方法主要利用鱼、菌、水生植物之间相互作用关系直接或间接抑藻，虽然生态友好，但是后期管理复杂且用时较长(胡利静等，2016；Ghernaout D，2013)。研究表明有些植物的浸提液可以控藻，比如稻草秸秆、菊科植物(刘燕婷，2011；张庭廷等，2021)。从不同植物中已提取、分离和鉴定出多种对淡水藻类起抑制或促进作用的活性物质，包括单酚、多酚、胺类、有机酸、醌类、黄酮类、萜类、酯类、芳香族化合物和其他一些种类，但是植物产生的化感物质具有选择性抑藻特性，不同化感物质的抑藻机理不尽相同(谢树莲等，2017)。

蓝藻细胞中的叶绿素a和藻胆素是主要光合色素，藻胆素常与蛋白质结合为藻胆蛋白，主要包括藻蓝蛋白(PC)、藻红蓝蛋白(PEC)和别藻蓝蛋白(APC)。本研究通过测定藻细胞密度和光合细胞相关蛋白含量变化，研究植物次生物质不同浓度对藻细胞生长的影响，以探究植物提取物控藻机理。本文选择3 种植物马缨丹、蟛蜞菊和羊蹄甲，研究分析其提取物对蓝藻细胞生长抑制效果，旨在为生物除藻提供理论依据。

一、材料与方法

1.微藻培养基

铜绿微囊藻采用常规的微藻培养基BG-11。称取0.85克BG-11培养基，量取500毫升纯水，置于1升锥形瓶、120℃下高压灭菌20分钟，备用。

2.植物提取液制备

将采摘的马缨丹、蟛蜞菊、羊蹄甲植物叶片用清水冲洗干净并晾干，再在烘箱60℃下烘干，然后用粉碎机粉碎成粉末(何书婷等，2017)。分别将3种植物叶片粉末100克置于锥形瓶中，按照料液比1∶10 加入乙醇，于20℃、150 转/分条件下振荡72 小时，再用4 层纱布过滤；接着用旋转蒸发仪旋蒸(100千帕、60℃)浓缩至膏状。之后用50%乙醇配成0.2、0.4、0.8 克/毫升3 个浓度梯度的待用溶液，置于4℃冰箱中备用。

3.藻种培养及植物提取液作用

藻种液与BG-11 培养基的接种配比为1∶10，培养温度为25℃，光照强度为3 000勒克斯，光照12 小时/天，每天上午与下午各摇动1 次(王捷等，2014)，培养1周备用。

30份80毫升的BG-11培养基中各加入1毫升铜绿微囊藻培养藻液，再分别加入含蟛蜞菊、马缨丹、羊蹄甲0.2、0.4、0.8 克/毫升3 种浓度梯度的植物浸提液1 毫升，每个浓度梯度设置3 个重复，并设置1个空白组。加样完毕后放置于光照培养箱中培养10 天，分别在实验第1、3、5、7、9 天取样测定铜绿微囊藻密度、叶绿素a 含量，在第10天测定藻胆蛋白含量。

4.微藻生物量测定

以崔研等(2012)藻生物量的测定方法为参考，确定铜绿微囊藻回归曲线。吸取藻液于计数板、置于显微镜下进行细胞计数，重复3次取平均值。铜绿微囊藻细胞初始密度为7.75×106个/毫升，将初始藻液与纯水按照1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9 的比例稀释为9个不同浓度，用酶标仪测定包括初始藻液在内的10 个不同浓度的光密度。根据光密度与藻细胞密度计算回归曲线。

吸取每个实验样品100 微升于96 孔板酶标板中测定波长440纳米处的吸光度，再通过线性回归方程将吸光度转换成为铜绿微囊藻的生物量。

5.叶绿素a含量测定

参考徐志飞等(2019)叶绿素a测定方法，吸取藻液5 毫升于10 毫升的离心管，离心机4 500 转/分，离心10分钟，倒掉上清液后在-20℃下进行冷冻，第2 天用水浴锅将乙醇加热至50～60℃，取4毫升乙醇，加入低温冷冻的铜绿微囊藻，水浴加热2分钟，放在遮光处暗反应6小时取出，用乙醇定容10 毫升，4 000 转/分离心10 分钟，取上清液于5 毫升离心管备用。在630、645、663、750 纳米波长下用紫外分光光度计测定上清液的吸光度(以BG-11培养基作为空白对照)，再计算叶绿素a含量(微克/毫升)。

6.藻胆蛋白测定

参考戴立洲等(2015)方法，第10 天取5 毫升藻液离心，4 500转/分离心7分钟，倒掉液体留下藻泥，加入配制好的冷磷酸缓冲液5 毫升于-20℃的冰箱中过夜。在常温下溶解，反复进行冷冻与溶解操作3 次，将液体转移至5 毫升离心管离心，以12 000 转/分离心10 分钟，取上清液测其在565、620、650纳米波长处的OD值，再计算藻胆蛋白含量(毫克/毫升)。

二、结果与分析

1.铜绿微囊藻细胞密度线性回归方程

测定结果显示光密度(吸光值)在0.1～0.7，铜绿微囊藻液藻密度线性回归方程为：Y＝0.0644X＋0.0584(R2＝0.996 3)，Y 是用酶标仪在440 纳米的波长所测得的藻液吸光度值，X 为铜绿微囊藻的细胞生物量(106个/毫升)。随着藻细胞密度的增加，吸光值增加。

2.不同浓度浸提液对铜绿微囊藻细胞密度生长的影响

3种植物浸提液对藻细胞繁殖均有明显的抑制效果，其中前3天蟛蜞菊和羊蹄甲浸提液对藻繁殖抑制速度最快，马缨丹较为缓慢(表1)。虽然前期马缨丹浸提液的抑制效果较差，但是在第9天3种植物浸提液均能有效抑制藻的生长。

表1 3种植物浸提液对铜绿微囊藻细胞密度的影响

蟛蜞菊浸提液第1天随着浓度的增加藻细胞密度增加，但是随后数天高浓度浸提液组的抑制效果比低浓度好，最终效果趋向一致，不同浓度组间差异不显著，藻密度最低为0.13×106个/毫升。

虽然羊蹄甲低浓度浸提液对藻生长抑制效果比高浓度好，但是两者之间在第9 天没有显著差异。马缨丹浸提液高浓度组在开始阶段藻细胞密度显著高于低浓度组，但是在第5～7 天显著低于低浓度组(P＜0.05)。

3.不同植物浸提液对铜绿微囊藻叶绿素a 的影响

3种植物浸提液均能显著降低铜绿微囊藻叶绿素a 含量(P＜0.05)，其中蟛蜞菊浸提液处理组在初始数天叶绿素a含量的下降速度明显高于其他两种植物，马缨丹浸提液对叶绿素a的抑制效果比较缓慢。

4.不同植物浸提液对藻胆蛋白的影响

藻胆蛋白可分为藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白，本实验测定结果显示在处理后的第10 天3种植物浸提液对藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白均有显著抑制作用。

三、讨论

化感物质被认为是抑制藻类生长的主要原因，植物释放的化学物质对其周围的生物产生有益或者有害影响、促进或者抑制周边植物或者微生物的生长发育现象被称为化感作用。化感物质可能存在于植物各个器官，包括叶、花、果实、根、茎等。化感抑制作用是由多种化感物质共同作用产生的生理过程，从而改变植物的生长方式(Ana B，2010)。本研究通过观察藻细胞增殖过程，结果显示3 种植物浸提液均显著抑制藻细胞繁殖。

有关化感作用的研究较多集中在对微生物细菌、真菌的抑制效果以及杂草防控、农作物培育、 植物病害治理等方面(Jeyasankar A，2014)，而利用植物化感物质抑制藻类生长研究相对较少。有学者认为植物本身可以产生次生代谢产物，再通过挥发此类物质来促进或者抑制其他植物的生长(汪小雄，2016)，比如马缨丹对黑麦草、水葫芦、蓝藻、热带豆科牧草的生长影响；柱花草有化感作用，能在不同程度上抑制杂草或藻类生长(李玉霞等，2019)。表现出对藻类抑制或促进增殖的效果与浓度有一定相关性，因此浓度阈值现象在一些研究中有所呈现，对藻类的抑制效果并不是随着浓度的增加而增加的线性关系，比如蟛蜞菊水提液对卵孢金孢藻具有低浓度促进高浓度抑制的作用(杜彩丽等，2019)。植物提取液对藻细胞的抑制作用与藻细胞初始接种密度有密切关系，低接种密度时抑制率极高，随着接种密度的升高抑制率下降；接种密度极高时，提取物不但不会抑制甚至还会促进藻细胞的生长(祁茜等，2019)。藻类的生长还涉及水体营养、溶氧、酸碱度等，在化感物质的干涉下导致水质的变化也是影响藻细胞繁殖的因素。

藻胆蛋白是一种天然色素荧光蛋白，辅助藻胆体捕获光能，与叶绿素a一样可以利用光能进行光合作用，影响蓝藻繁殖生长(Daginno L J，2022)。本次研究结果表明，3 种植物浸提液均能显著降低叶绿素a和藻胆蛋白含量；植物浸提液通过降解藻胆蛋白、减少光合作用抑制藻类生长。综上，本研究为开发植物源生物抑藻提供科学依据，利用植物次生物质作用抑藻具有经济安全等优点，如果对入侵性植物加以利用，更是化害为利。