空腹血清果糖暴露对老年人群骨代谢细胞因子的影响

苏威武, 刘效成, 覃心如, 王穆,

1.长沙市岳麓区疾病预防控制中心,湖南长沙 410013;2.南华大学衡阳医学院附属南华医院临床研究所,湖南衡阳 421002;3.南华大学衡阳医学院公共卫生学院,湖南衡阳 421001

自1967年引入高果糖玉米糖浆(high fructose corn syrup,HFCS)以来,果糖的消费量迅速增加[1-5]。果糖摄入对骨骼健康的影响日益受到重视[6-8]。但目前在人群水平上的研究甚少。本研究应用流式细胞仪检测了老年果糖暴露人群和非暴露对照人群血清13种骨代谢细胞因子的含量,包括骨保护素(osteoprotegerin,OPG)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、血小板衍生因子-BB(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)、肝/骨/肾碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,liver/bone/kidney,ALPL)、抗酒石酸酸性磷酸酶5(tartaric acid resistant acid phosphatase 5,ACP5)、瘦素(leptin)、核因子-κB受体活化因子配体(nuclear factor-κB receptor activating factor ligand,RANKL)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-6、甲状旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)、IL-1β、骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)和dickkopf WNT信号通路抑制剂-1(dickkopf WNT signaling pathway inhibitor 1,DKK-1),并分析两组人群中这些骨代谢相关细胞因子的差异,以期为老年人群骨代谢相关疾病的防治提供科学依据。

1 资料和方法

1.1 主要试剂与设备

骨代谢流式多因子检测试剂盒购自美国LEGENDplexTM公司(Cat.No.741360);果糖检测试剂盒购自上海臻科生物科技有限公司(Cat.No.G20221010H);双激光6色流式细胞仪购自深圳市达科为生物技术股份有限公司(型号:EXFLOW-206-0016)。

1.2 人群的选择

课题组前期对湖南省衡阳市某社区约2 000人空腹血清进行了果糖检测。从中随机抽取37名果糖高暴露老年人及37名未检出血清果糖且严格匹配年龄和性别的老年人为本研究的对象,并检测两组研究对象血清13个骨代谢细胞因子的含量。所有研究对象均填写了知情同意书。本研究方案经南华大学附属南华医院伦理委员会批准(伦理批准号2022-KY-167)。所有试验根据《赫尔辛基宣言》或其他相关指南和法规的原则进行。

1.3 血清果糖检测

采用微板法检测晨起空腹血清果糖质量浓度。主要原理:果糖经特异性酶的作用后转化为葡糖糖,葡萄糖在己糖激酶等酶复合物的作用下,使还原型辅酶Ⅱ的量不断增加,用酶标仪检测340 nm下该物质的增加量,进而计算得到果糖质量浓度。

1.4 血清骨代谢细胞因子检测

首先将预混合珠瓶在超声仪浴中超声处理1 min,并在涡旋中超声处理30 s;将20×洗涤缓冲液加热至室温,混匀使所有盐溶解;用475 mL去离子水稀释25 mL 20×洗涤缓冲液,未使用的部分储存在2～8 ℃,最长可储存1个月。添加5.0 mL LEGENDplexTM测定缓冲液至装有冻干Matrix A的瓶子中,涡旋≥15 min以使其完全溶解,剩余的Matrix A在≤-70 ℃下保存不能超过1个月。取50 μL空腹血清样本加入50 μL测试缓冲液,将所有试剂放至室温后加入“V”形底板。流式细胞仪主要设置参数为报告通道FL2;通道发射激光575 nm;分类通道FL4;通道发射激光660 nm。

1.5 统计学分析

采用SPSS 21.0统计软件分析。正态分布资料采用两样本均数t检验,非正态分布资料采用秩和检验;两样本率的比较采用卡方检验;果糖与骨代谢相关细胞因子间的关联关系采用多变量Logistics回归模型分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 果糖暴露与非暴露人群的一般资料比较

与未检出血清果糖的人群相比,果糖暴露人群高密度脂蛋白显著降低、心率显著升高(P<0.05;表1)。

表1 果糖暴露与非暴露人群一般资料比较(n=37)

2.2 13种骨代谢相关细胞因子水平的标准曲线拟合情况

如图1所示,空腹血清13种骨代谢细胞因子的标准曲线拟合良好(R2>0.99),其中,OPG、OPN、PDGF-BB、ALPL、ACP5、leptin、PTH、DKK-1等因子的拟合曲线的R2>0.999。

图1 13种骨代谢相关细胞因子的标准曲线拟合情况

2.3 果糖高暴露老年人群与对照人群血清骨代谢细胞因子的水平差异分析

与未检出血清果糖的人群相比,果糖高暴露人群血清OPN、ALPL、IL-6、DKK-1等细胞因子显著升高(P<0.05;表2),其中,OPN增加最显著,增加2.39倍。

表2 果糖暴露对空腹血清骨代谢细胞因子的影响(n=37) ng/L

2.4 老年人群果糖暴露与血清骨代谢细胞因子的关联关系分析

采用Logistic回归模型分析了空腹血清果糖与骨代谢细胞因子之间的关联关系,发现血清果糖与上述13个骨代谢细胞因子之间的关联关系均没有统计学意义(P>0.05,表3)。

表3 血清果糖对骨代谢细胞因子影响的OR值和95%置信区间

3 讨 论

随着年龄的增加,骨骼疾病的发病风险也随之增加,绝经后女性及老年群体患病风险更高。2006年统计数据显示,中国已经有接近7 000万骨质疏松患者及超过2亿的骨量减少患者[9]。随着人口老龄化的加剧,中国骨代谢相关疾病患者的数量还将上升。

果糖有两大代谢特征:首先,果糖显著增强糖酵解,抑制能量消耗、促进脂肪及糖原的生成;其次,果糖在进入细胞后被快速磷酸化,导致细胞内磷酸盐急剧下降,从而激活一磷酸腺苷脱氨酶-2,促使一磷酸腺苷降解为肌苷酸并最终降解为尿酸[10]。在食物缺乏的条件下,果糖独特的代谢机制增强了人类祖先的生存能力;但在当前普遍能量过剩的情况下,果糖可能增加肥胖、代谢综合征及高尿酸血症的发病风险[10]。然而,果糖对骨代谢的影响目前还缺乏人群水平的证据。本研究应用小样本人群探索性分析发现果糖高暴露人群血清OPN、ALPL、IL-6和DKK-1显著升高。

成骨细胞表面的RANKL、NF-κB受体的活化因子(RANK)和OPG是破骨细胞发生和调节骨吸收的关键决定因素[11]。在去卵巢大鼠模型中,给予10%的果糖喂食能显著升高RANKL[12]。本研究在人群水平上并没有发现果糖暴露对RANKL和OPG有显著影响。

IL-6能上调成骨细胞表面RANKL的表达和加速RANK信号,从而直接导致骨质破坏[13]。本研究中,IL-6显著升高但RANKL没有明显变化,表明果糖暴露能增加机体的炎症水平。成骨细胞、骨细胞及破骨细胞均可分泌OPN,在骨基质的矿化和吸收过程中有重要作用。研究发现,类风湿性关节炎患者血清OPN显著升高,其中,伴有骨侵蚀的患者血清OPN更高[14]。OPN在正常细胞和组织中的表达受抑制,只有在炎症或组织损伤时其表达才增强。果糖暴露导致OPN显著升高,可能与果糖暴露升高机体炎症水平有关系。

DKK-1是dickkopf家族的成员。研究发现,类风湿关节炎患者循环DKK-1水平显著升高,且DKK-1的异常表达引起的骨代谢功能障碍参与了类风湿关节炎中病理性骨侵蚀的发病[15]。本研究结果显示,果糖高暴露人群血清DKK-1显著增高,提示果糖暴露可能与类风湿关节炎有关,但还需进一步的证据。

ALPL在肝脏、骨骼和肾脏中分布最多,在碱性条件下(pH 8～10)能水解磷酸单酯,从而参与骨骼的矿化过程[16]。果糖暴露人群ALPL水平的升高并不代表果糖暴露能增加骨骼的矿化,还应检测ALPL的活性。

本文结果显示,果糖暴露显著降低高密度脂蛋白、显著升高心率。高密度脂蛋白具有抗炎、抗氧化及血管保护等生物学作用[17]。既往一项大型随机对照研究也报道了果糖暴露与高密度脂蛋白显著降低有关[18];在慢性肾病患者中也观察到果糖能降低高密度脂蛋白[19]。果糖对高密度脂蛋白的降低作用可能与其能加强脂肪生成有关[10]。在果糖升高心率方面,既往有动物实验结果与此一致[20],可能与果糖的血压保持作用有关[10]。

本研究应用流式细胞术检测了37名高果糖暴露人群和37名对照人群血清骨代谢相关细胞因子的改变情况,发现OPN、ALPL、IL-6和DKK-1四种细胞因子与果糖暴露显著相关。但所纳入的样本量相对较小,回归分析的结果为阴性可能与此有关,后期应该在此研究的基础上开展更大规模的人群流行病学研究进行验证。