基于二代测序技术探究葛根素治疗酒精性肝炎的潜在分子靶点

张霞霞, 郎艳飞, 徐有青

1.首都医科大学附属北京天坛医院消化内科,北京 100070;2.北京大学第三医院消化内科,北京 100191

酒精性肝炎(alcoholic hepatitis,AH)导致约10%～20%患者肝硬化,而酒精性肝硬化是肝脏相关病例死亡的主要原因[1]。目前临床上AH的有效治疗手段欠缺,因此,积极寻找其有效治疗AH的临床药物甚为急迫[2-3]。葛根素是从葛根中分离的天然异黄酮类衍生物活性物质,具有抗肿瘤和抗病毒的作用,可解诸毒,尤善解酒醒脾[4-6]。本课题组前期研究已论证葛根素对酒精性肝炎具有较好的治疗作用,但具体作用机制及作用靶点尚未明确[7-8]。本研究基于分子二代测序技术探究葛根素治疗AH的潜在分子靶点及作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

C57BL/6雄性小鼠(维通利华公司);葛根素(山西西安瑞林生物科技有限公司);TRIzol试剂盒(Invitrogen公司,美国);反转录试剂盒(Takara公司,日本);分光光度计及Qubit3.0荧光定量仪(赛默飞世尔科学公司);全自动生化分析仪(Hitachi-7180);Illumina平台(型号DR08502,武汉)。

1.2 实验动物及处理

8周龄健康雄性C57BL/6小鼠9只,饲养于(23±2)℃、湿度40%～70%,12 h黑夜/白昼标准环境中,自由进食饮水。适应性喂养1周后,随机均分为对照组、AH组、葛根素组。AH组及葛根素组予含5%Lieber-DeCarli酒精液体饲料饲养,第6周予乙醇灌胃1次(5 g/kg),葛根素组在酒精饲养同时,尾静脉注射葛根素(4.2 mg/kg,1次/日),对照组予同等热量液体饲料饲养。第8周末各组小鼠进行安乐死,留取血清及组织标本。

1.3 肝功能指标测定

待血液凝固后,离心5～10 min,3 000 r/min,取上层血清置于全自动生化分析仪设定位置上,进入“校准登记”后,测定谷丙转氨酶(glutamic-pyruvic transaminase,GPT)和谷草转氨酶(glutamic-oxaloacetic transaminase,GOT)。

1.4 RNA提取与质检

研磨的肝组织标本加入1 mL TRIzol涡旋混匀;置于冰上数分钟至溶液澄清,加200 μL氯仿,摇晃15 s,冰上放置2～3 min;离心后取上层转移至EP管中,加入1倍体积异丙醇,混匀,-20 ℃放置30 min,离心后弃上清,加入1 mL 75%乙醇洗涤、离心,重复上一步骤,弃上清,小枪头吸净管中液体,室温干燥2 min,加适量DEPC水溶解RNA,Nanodrop仪器对RNA浓度和纯度进行测定,使用Qesp1000(RQN值)检测RNA的完整性。

1.5 肝脏组织HE染色

将肝脏组织标本浸泡于福尔马林中4～6 h,OCT包埋盒固定样本,流水冲洗过夜10 h。将组织装入包埋盒中,应用Leica ASP300S全自动脱水机脱水、透明和浸蜡,切片后进行HE染色,中性树胶封片,于光学显微镜下观察,采集图像。其中肝脏组织学活动性采用Knodell组织活性指数(histological activity index,HAI)评估[9],总分22分,分数越高表示坏死越严重。

1.6 肝脏组织油红O染色

取新鲜肝脏组织液氮速冻后,OCT包埋,6～8 μm切片,蒸馏水充分洗涤,油红染色10～15 min,HE染核1～2 min,水洗,盐酸酒精分化,返蓝,水洗,甘油明胶封片,光学显微镜下观察,采集图像。脂肪变性评分参考文献[10],总分4分,分值越高表示脂肪变性程度越高。

1.7 RNA-Seq测序及分析

取5 μg总RNA建库,利用磁珠回收目的大小片段进行PCR扩增,质检合格后上机测序。使用FastQC进行质量控制,具有≥90%覆盖度的参考序列比对的读数保留,通过质量过滤器(CLC Genomics Workbench v4.9)的序列使用。获得高质量的测序数据,将数据比对到项目物种的参考基因组上,获得全面转录本信息,采用Trimmomatic 0.36软件获取质控数据和edgeR 3.12.1软件(http://bioconductor.org)识别组间差异表达基因,使用KOBAS 2.2.1软件(http://kobas.cbi.pku.edu.cn.)进行基因表达定量及GO、KEGG分析。

1.8 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计量资料采用t检验,GO及KEGG富集条目P通过Fisher精确检验,相关性分析通过Pearson法进行计算。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠肝组织学形态及血清GPT、GOT变化

HE及油红O染色结果显示,对照组小鼠肝细胞形态完整、细胞核无增大、肝小叶形态完整;AH组小鼠弥漫性脂滴堆积和局灶性炎症细胞浸润;葛根素组肝组织炎症较AH组改善,脂肪变性明显减轻。葛根素组HAI评分较AH组明显下降(P<0.05)。AH组较对照组GPT、GOT水平明显升高(P<0.05),而葛根素组较AH组GPT、GOT水平则明显下降(P<0.05;图1)。

图1 各组小鼠肝组织学形态及血清学变化a为P<0.05,与AH组比较;b为P<0.05,与对照组比较;c为P<0.05,与葛根素组比较。

2.2 RNA提取及质检结果

OD260/280、OD260/230均大于1.8,完整性检测较好(RQN值均大于7.0),琼脂糖凝胶电泳检测RNA文库插入片段大小在400 bp左右(图2A)。3例AH组和3例葛根素组分别获得55 601 831个和52 934 410个矫正后短测序片段,主要分布在外显子区,其次是内含子区及基因区间区(图2B)。

图2 RNA提取及质控结果A为琼脂糖凝胶电泳检测文库插入片段大小;B为各标本测序片段在参考基因组上不同区域的占比图;C为AH组;T为葛根素组。

2.3 基因表达的层次聚类结果

采用RPKM值作为基因表达量的衡量指标消除基因长度和测序量差异对计算基因表达的影响。基因表达的层次聚类结果如图3所示,绿色、红色分别代表通过基因表达水平获得较低的样品间相关性和较高的样品间相关性。由同一节点产生的分支线段代表对应的样品可以聚到一类,分支的长度代表样本的相似度:长度越短,样本间相似度越高;长度越长,样本间相似度越低。

图3 基因表达的层次聚类结果图(C为AH组,T为葛根素组)

2.4 GO功能富集分析与KEGG通路分析

AH组和葛根素组间有较多差异表达基因,上调178个,下调258个(图4)。在差异表达基因中显著富集的GO功能条目包括574个为生物过程,141个为分子功能,64个为细胞组分。涉及的GO富集量主要集中在脂质分解代谢过程的正向调节、细胞骨架的结构组成、微管等方面(图5)。研究显示两组间差异表达基因被分为45条KEGG通路。两组间上调和下调的差异表达基因前10条KEGG通路见图6。

图4 AH组及葛根素组间差异表达基因散点图

图5 差异表达基因中显著富集的GO功能条目

图6 KEGG通路结果

3 讨 论

随着经济发展及生活方式的改变,酒精性肝病的发病率逐年上升;全球每年大约250万人死于过量饮酒,是15～49岁年龄段壮年男性的主要致残病因,造成巨大社会经济负担[11-12]。研究表明,除戒酒及肝移植外,糖皮质激素仅被认为对晚期酒精性肝硬化有效,但对长期生存率的改善度尚未可知,同时禁忌证较多限制了其临床应用[13]。

葛根素在较多疾病中的抗炎作用已得到初步证实,如在结肠炎[14]及肾损伤中发挥保护作用[4],在酒精性肝损伤中可促进酒精代谢作用,也可通过调节肝细胞上皮-间充质转化改善肝纤维化[8,15-17];但其抗酒精性肝损伤的机制研究甚少,治疗作用靶点尚未明确。本研究对葛根素治疗的AH小鼠进行基因转录组二代测序,探究其潜在作用靶点,为临床用药提供实验依据[18]。

本研究显示AH小鼠造模成功,同时葛根素治疗组较AH组转氨酶明显下降,HAI评分及脂肪变性评分均明显改善,提示葛根素对酒精性肝炎具有一定的保护作用。鉴于目前可获取的临床治疗酒精性肝炎的药物有限,葛根素可作为潜在治疗酒精性肝炎的临床用药。本研究进一步通过二代测序技术探究葛根素治疗酒精性肝炎的可能靶点,测序结果显示,AH组、葛根素组分别平均获得55 601 831个和52 934 410个矫正后短测序片段,测序片段主要分布在外显子区,其次是内含子区及基因区间区。AH组和葛根素组间差异表达基因中,下调258个,上调178个。通过GO成功注释,574个差异表达基因为生物过程,141个为分子功能,64个为细胞成分。特异性差异表达上调基因进行了详细的GO项富集分析,主要涉及到有机酸代谢、细胞骨架的结构组成、双链RNA结合、微管、髓鞘、外泌体等。两组间上调和下调的差异表达基因进行了KEGG富集分析,主要富集在氨基酸代谢途径以及缝隙链接、吞噬体、谷胱甘肽代谢、P53信号通路等,其中氨基酸代谢(酪氨酸代谢、精氨酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢)途径可能是葛根素作用治疗的潜在靶点,为后续进一步研究提供了有利证据。

综上所述,葛根素对改善酒精性性肝炎具有一定疗效,可能作为潜在的酒精性肝病的临床治疗用药,本研究使用二代测序技术对葛根素治疗酒精性肝炎小鼠的转录组进行全面分析,探究葛根素治疗潜在靶点,为葛根素药物在酒精性肝病治疗方面提供理论基础,为酒精性肝病提供新的临床治疗药物。