昼夜环境紊乱对缺血性中风后血管新生的影响及活血荣络方的干预作用

曾富康,张宇星,周德生,陈 瑶,李 中,刘利娟

(1. 湘西州民族中医院重症医学科,湖南 吉首 416000;2. 湖南中医药大学第一附属医院脑病科,湖南 长沙 410007 )

脑梗死又称缺血性中风(ischemic stroke,IS)是由于脑血流供应障碍导致脑组织缺血缺氧并出现相应神经功能缺损的一种神经内科常见病、多发病,是我国成人致死、致残的重要病因[1]。脑梗死后脑组织的存活和功能恢复取决于脑缺血/再灌注和功能侧支循环的建立,研究表明调控侧支循环建立是治疗脑梗死的重要思路[2]。脑侧支循环可为急性缺血区域提供血流,从而使缺血组织得到不同程度的灌注代偿,而血管新生是脑梗死后侧支循环构建的重要过程,促进血管生成是改善脑梗死后神经功能恢复的策略之一[3]。

昼夜节律是指在复杂的生物钟基因精密的网络调控下,产生大约24 h为周期的节律震荡,调节着机体稳态,控制着多种生理和病理过程,如细胞增殖、DNA损伤修复、血管生成、炎症和免疫反应等[4]。研究表明,通过光相照射差异导致的昼夜环境紊乱(environmental circadian disruption,ECD)可加重脑梗死后神经功能缺损症状,增加脑梗死体积。生物钟基因的节律振荡控制着血管生成,核心钟基因Bmal1和Per2的破坏,会明显损害斑马鱼血管发育,进一步研究证实Bmal1可直接靶向血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因的启动子区域,导致VEGF的表达上调[5]。

活血荣络方是本团队根据治疗脑梗死多年的临床经验,在“荣气虚滞理论”的指导下,依据阴虚血瘀病机,制定了具有调和阴阳、养阴生津、活血养血、舒筋活络通脉功效的科室协议方,其组成以鸡血藤、石楠藤为君,生地黄、玄参、黄精为臣,乳香、没药为佐、川芎为使。现为湖南中医药大学第一附属医院院内制剂,已纳入临床路径10余年,前期课题组实验研究发现,该方可明显增加脑梗死模型海马区CD34阳性细胞及皮质区VEGF表达,升高梗死周围脑组织中微囊蛋白-1(caveolin-1,CAV-1)的表达,增加脑缺血区微血管密度(microvessel density,MVD),促血管新生[6-7]。

本次研究旨在探讨昼夜节律紊乱对脑梗死血管新生的影响以及活血荣络方的干预机制。

1 材料

1.1 实验动物10～12周龄雄性SPF级SD(Sprague-Dawley,SD)大鼠50只,体质量200 g左右,购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司,饲养于湖南中医药大学第一附属医院医学创新实验室动物中心,实验许可证号:SYXK(湘)2020-0010,依照实验动物中心管理法则,饲养7 d后用于实验。用于本次实验研究动物经湖南中医药大学第一附属医院伦理委员会批准(伦理批准号:20201010-13)。

1.2 药物与试剂

1.2.1药物 活血荣络方由鸡血藤30 g(批号:2105082)、石楠藤30 g(批号:2020061904)、生地黄15 g(批号:SX21102701)、玄参10 g(批号:K21092706)、黄精15 g(批号:2110083)、乳香10 g(批号:210702)、没药10 g(批号:2020092102)、川芎10 g(批号:SX21093002)组成,其比例为6 ∶6 ∶3 ∶2 ∶3 ∶2 ∶2 ∶2,所用药材均购自湖南中医药大学第一附属医院中药房,经湖南中医药大学第一附属医院张裕民主任药师鉴定分别为豆科植物密花豆SpatholobussuberectusDunn的干燥藤茎、胡椒科植物石楠藤Piperwallichii(Miq.) Hand.-Mazz.的干燥带叶茎枝、玄参科植物地黄RehmanniaglutinosaLibosch.的干燥块根、玄参科植物玄参ScrophularianingpoensisHemsl.的干燥根、百合科植物黄精PolygonatumsibiricumRed.的干燥根茎、橄榄科乳香树属植物乳香树BoswelliacarteriiBirdw.树皮渗出的树脂、橄榄科植物地丁树CommiphoramyrrhaEngl.的干燥树脂、伞形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根茎,均符合《中国药典》2020年版规定。制备方法:① 提取:各药混合于置圆底烧瓶中,加10倍量水浸泡煎煮2 h后,用冷凝回流装置回流收集,提取第一次液,过滤残渣后再加8倍量水,继续冷凝回流1 h,提取第二次液过滤,合并两次过滤液于旋转蒸发仪上进行浓缩,即得活血荣络方浸膏,4 ℃保存备用。根据人动物体表面积换算法(给药剂量=0.018×人给药剂量÷大鼠体质量),取蒸馏水将活血荣络方浸膏按1 mL/100 g配比稀释为每1 mL含生药为 1.1 g的药液灌胃,采用高效液相色谱法对活血荣络方进行质量控制,其主要有效成分芒柄花素、薯蓣皂苷、正丁烯基苯酚、黄芩苷的质量分数分别为4.298、3.568、1.779、18.634 mg·g-1。

1.2.2试剂 BCA蛋白定量试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司,批号:4MFGL16GFF);Immobilon Western HRP底物(美国Millipore,WBKLS0100);PageRulerTMPrestained Protein Ladder(美国Thermo Scientific,批号:26616);抗体:Bmal1、VEGF(美国Abcam,ab230822、ab46154),MMP2、MMP9、Per1、β-actin(武汉三鹰,10373-2-AP、10375-2-AP、13463-1-AP、00097044),CoraLite594二抗(1 ∶100,SA00013-4,Proteintech);VEGF、褪黑素(melatonine,MT)、IL-1β、TNF-α和IL-18)ELISA试剂盒(武汉华美生物科技有限公司,CSB-E04757r、CSB-E13433r、CSB-E04610r、CSB-E08055r、CSB-E11987r)。

1.3 仪器与耗材石蜡切片机(美国Thermo Scientific,);显微成像系统(中国Motic);Mini-Protean Tetra小型垂直电泳槽(美国Bio-rad)、PowerPac Basic基础电泳仪(美国Bio-rad);MCAO线栓(北京西农,2838-A4);0.45 μm PVDF膜(ISEQ00010,Millipore);台式高速冷冻型微量离心机(中国DragonLab);荧光定量PCR仪(美国Bio-rad);超微量分光光度计(美国Thermo Scientific);超净工作台(中国苏净安泰公司);标准试剂型纯水仪(中国青岛富勒姆科技有限公司);多功能酶标仪(美国Perkinelmer)。

2 方法

2.1 大鼠环境昼夜节律紊乱(environmental circadian disruption,ECD)模型制备方案ECD模型的建立通过改变光照时相完成。SD大鼠在光照干预前正常饲养2周,以适应环境设施及饲养条件。2周后随机分至各组,非ECD模型予以正常昼夜交替12 h(12 D ∶12 L)光照方案。同时,在不改变昼夜时长的前提下,我们将ECD模型的光照开启时间提前6 h,每7天提前1次,持续6 周,以模拟轮班工人导致的昼夜节律紊乱状态,详细方案见Fig 1。

2.2 大鼠脑缺血/再灌注模型的制备MCAO手术被安排在ECD过程的第6周的最后1天,为排除内源性节律振荡导致的差异,故造模的时间分为两个时间段,6 ∶00-12 ∶00为ECD组造模时段,12 ∶00-18 ∶00为非ECD组造模时段,详见Fig 1。术前禁食12 h,不禁水。使用10%水合氯醛(0.35 g·kg-1)腹腔注射麻醉大鼠,麻醉后,使用大脑中动脉阻塞法(middle cerebral artery occlusion,MCAO),梗阻大鼠右侧大脑中动脉,具体操作参考Longa等[8]报道。钝性分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA),从ECA与ICA分叉部约(4±2) mm处剪口进拴线,插入拴线约(18±2) mm,将ICA挂线系牢;缺血2 h后,拔出拴线进行再灌注,以制备大鼠脑缺血(MCAO)模型。

Fig 1 ECD protocol

2.3 分组及给药将50只SD大鼠随机分为假手术组10只、MCAO模型组40只,假手术组分离CCA、ECA、ICA,不插入拴线,余过程与模型制备方法相同,造模组予以大鼠MCAO模型制备方法造模。参考Zea-Longa′s级标准评分法,取造模后1～3分大鼠进行后续实验。将MCAO法造模后的40只大鼠,随机分为模型组(MCAO)、活血荣络方组(MCAO+HXRLF)、模型+节律紊乱组(MCAO-ECD)及模型+生物节律紊乱+活血荣络方组(MCAO-ECD+HXRLF),每组10只。实验过程中出现死亡、取材时发现蛛网膜下腔出血或脑出血剔除,根据需要予以补充。各组大鼠于术后6 h,沿用团队前期实验验证的药物剂量及周期进行灌胃给药,假手术组与非药物组予以生理盐水(10 mL·kg-1);活血荣络方组予以活血荣络方药液(11.7 g·kg-1)各组每日固定时间点灌胃给药1次,连续10 d。

2.4 神经功能缺损评分大鼠神经功能采用改良神经功能缺损评分(mNSS)进行评价,其中包括运动、感觉、平衡木、反射消失或动作异常共18 分,评分越高,损伤程度越严重,各组大鼠分别于术后24 h、3 d、7 d、10 d进行评分。由于术后3 d与7 d进入第七周,10 d进入第八周,为排除内源性节律振荡导致的差异,故后3次的功能评价均在光照时相开启后的2 h内完成。

2.5 HE染色法观察大鼠脑组织病理学表现大鼠在MCAO手术后再灌注24 h取完整脑组织,使用4 %多聚甲醛溶液浸泡固定脑组织,经脱水、透明、石蜡包埋后,制作成切片(4 μm)。切片脱蜡、复水、使用苏木素及伊红染色后,指甲油封片,镜下观察脑组织病理学变化情况。

2.6 免疫荧光检测大鼠脑组织中CD34的表达采用免疫荧光法检测脑组织海马区及皮质区CD34表达,以检测脑梗死后海马及皮质区新生血管。石蜡切片脱蜡至水后,置于EDTA抗原修复缓冲液(pH 8.0)中,置于微波炉内进行抗原修复,自然冷却后使用PBS脱色。然后使用BSA孵育30 min封闭,将切片与抗CD34在4 ℃孵育过夜。PBS洗涤后加CoraLite594二抗,避光室温孵育50 min,洗涤后加DAPI染液,避光室温孵育10 min,洗涤后用抗荧光淬灭封片剂封片。最后切片于荧光显微镜下观察并采集图像,采用ImageJ 1.8.0软件,在镜下随机取海马区3个视野,分别对3个视野中CD34阳性细胞计数,取3个视野的均数。

2.7 Western blot法检测各组大鼠脑组织中MMP2、MMP9、VEGF、BMAL1、Per1的表达将各组脑组织冰上放置,加入组织裂解液(RIPA裂解液 ∶蛋白酶抑制剂=100 ∶1)后,均浆机充分捣碎研磨提取总蛋白。采用BCA法定量总蛋白浓度。采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质量浓度,配制成2 g·L-1的蛋白体系,每孔上样量为10 μL,蛋白样品经凝胶电泳,转至PVDF膜,5%牛奶室温封闭60 min,加一抗MMP2(1 ∶200),MMP9(1 ∶2 000),VEGF(1 ∶1 500),Bmal1(1 ∶1 000),Per1(1 ∶1 500),β-actin(1 ∶8 000),4 ℃孵育过夜,加入山羊抗兔IgG抗体(1 ∶8 000),37 ℃孵育60 min。使用Image-Lab检测图像灰度值并进行分析。

2.8 ELISA法检测大鼠血清中VEGF、MT、IL-1β、TNF-α和IL-18含量采用ELISA法检测血清中VEGF、MT、TNF-α、IL-1β和IL-18的水平,参照ELISA试剂盒中说明书进行操作,将ELISA试剂盒中的孔分为空白对照孔、标准品孔及待测样品孔,然后加样,在37 ℃的条件下孵育2 h,然后洗板、甩干板,最后加入抗体检测液、反应液和底物液显色放入酶标仪中检测各组在450 nm波长中的A值分析数据。

3 结果

3.1 大鼠一般情况造模6周后,非ECD组精神状态好,饮食二便正常,体质量稳定,行动自如灵敏,背毛白色、浓密、干净、有光泽;ECD组精神相较差,进食量、饮水量均明显下降,体质量降低,毛色暗淡,自发性活动减少,对外界敏感性降低,背毛油腻、灰黄、脆,部分脱落。

3.2 各组大鼠神经功能评分的比较与假手术组相比,其余4组的mNSS评分均明显升高(P<0.01);MCAO-ECD组评分较MCAO组升高,缺血/再灌注损伤后的d 7 (P<0.05)及d 10(P<0.01)差异有统计学意义;各给药组d 10评分较MCAO及MCAO-ECD组均降低(P<0.05),见Fig 2。

3.3 ECD对大鼠脑组织病变的影响如Fig 3所示,假手术组大鼠脑皮质区细胞形态完整、排列整齐、边缘清晰、细胞核与间质着色均匀;MCAO组大鼠脑海马区细胞形态破坏、呈液化性、空泡样坏死、细胞间隙增大、残存细胞体积缩小、细胞核固缩、深染、细胞边界不清;MCAO-ECD组神经元细胞坏死、核固缩、结构破坏均加重;各给药组大鼠脑皮质细胞形态、排列、细胞核清晰度以及间质染色均匀度等均有不同程度改善。

3.4 ECD降低缺血/再灌注血管新生能力及活血荣络方的干预作用如Fig 4所示,相较于假手术组MCAO组中CD34阳性细胞数明显增高(P<0.05),MCAO-ECD组则较其减少(P<0.05);各给药组可不同程度增加各组CD34表达量,MCAO+HXRLF组明显增加皮质(P<0.01)及海马区(P<0.05)CD34阳性细胞数量,MCAO-ECD+HXRLF组皮质及海马区CD34均明显增加(P<0.05)。

Fig 2 Effect of ECD on mNSS score of MCAO rats and intervention effect of Huoxue Rongluo Recipe

3.5 ECD降低血管生成因子及活血荣络方的调控作用如Fig 5所示,与MCAO组相比,MCAO-ECD组的血管生成因子MMP-2、MMP-9、VEGF蛋白表达明显降低(P<0.05),各中药干预组的MMP-2、MMP-9、VEGF蛋白表达量均有不同程度升高(P<0.05或P<0.01)。

3.6 ECD降低Bmal1及Per1蛋白表达及活血荣络方的调控作用Fig 6所示,与MCAO组相比较,MCAO+HXRLF组中Bmal1及Per1蛋白表达量明显升高(P<0.01),MCAO-ECD组中的Bmal1及Per1明显减少(P<0.01),而MCAO-ECD+HXRLF组可明显增加Bmal1及Per1蛋白表达量(P<0.01)。

Fig 3 ECD aggravated pathological changes of cerebral cortex in MCAO rats and improvement of Huoxue Rongluo Recipe in cerebral ischemia rats (×100,×400)

Fig 5 ECD decreased expression of MMP-2,MMP-9 and VEGF in brain tissue of MCAO rats and effect of

Fig 6 ECD reduced expression of Bmal1 and Per1 protein in MCAO rat brain and intervention effect of Huoxue Rongluo Recipe

3.7 ECD对血清VEGF、MT和炎症因子的影响,及活血荣络方的调控作用结果如Fig 7所示,与假手术组相比,MCAO组的血清VEGF表达量明显升高(P<0.01),MT则降低(P<0.01),而MCAO-ECD组中的VEGF与MT含量进一步降低(P<0.05或P<0.01),各给药组的血清VEGF及MT含量明显增高(P<0.05或P<0.01)。MCAO组中的IL-1β、IL-18和TNF-α相比假手术组明显升高(P<0.05或P<0.01),且MCAO-ECD组进一步升高IL-1β和TNF-α血清含量(P<0.05或P<0.01)。各药物干预组均明显降低上述3种炎症因子含量(P<0.05或P<0.01)。

Fig 7 Effect of ECD on VEGF,melatonin,IL-1β,IL-18 and TNF-α in SERUM of MCAO rats and intervention of

4 讨论

脑梗死疾病发生后,脑动脉闭塞后脑血流量下降至临界水平以下,导致神经元细胞死亡,导致神经元电活动停止和血管发育功能障碍,故脑微血管网络功能的重建在局部血供和脑卒中恢复过程中显得尤为重要[9]。血管新生作为三级侧支循环,是一种新的微血管网络形式,它由现有的血管中分离,向发生在边界区的受影响区域提供氧气和营养物质。报道表明,高度的新生血管功能在一定程度上促进神经康复和功能恢复,因此,促进缺血后血管生成是临床治疗缺血性脑卒中的关键目标之一。缺血缺氧损伤时,内皮细胞 (endothelial cells,ECs)激活,释放VEGF、 MMPs降解细胞外基质(extracellular matrix,ECM)、基底膜 (basement membrane,BM)和基质,将周细胞与血管壁和基膜分离。血管通透性进而增加以响应VEGF的渗出,从而血浆蛋白通过形成原始支架的结构来协助ECs迁移。在上述促生长因子的协同作用下,ECs大量增殖和迁移,活化的ECs聚集并形成管腔,迁移到不同的截面,诱导新生血管形成,分泌黏附分子诱导新生血管向前端生长,组织成新的血管网络[10]。新的毛细血管依赖于基底基质的协调重塑和末端细胞后面的内皮细胞的延伸,包括周细胞和平滑肌细胞的招募,以芽的形式在原始血管上线性生长。

昼夜节律是一种综合调节系统,由哺乳动物内源性生物钟主导,控制机体的睡眠-觉醒周期、体温、激素分泌等,在代谢调节中起着至关重要的作用。转录-翻译-翻译后反馈抑制(transcriptional-translational feedback loops,TTFLs)是哺乳动物分子生物钟的基础,大约需要24 h完成。一组核心生物钟基因及其蛋白参与其中,具有b HLH-PAS (basic Helix-Loop-Helix-Per-Arnt-Sim)结构域的Bmal1、Clock蛋白结合形成异源二聚体,作为反馈环路的正性调控元件,从E-box位点促进Per、Cry转录翻译。而PER/CRY复合物在细胞质积聚过量进入细胞核,抑制Clock与Bmal1的转录,进而抑制自身的转录过程[11]。研究报道表明,由光相差异诱导的昼夜节律紊乱可增加脑梗死体积,加重免疫炎症反应,损伤内皮功能[12]。不仅如此,生物钟蛋白调控血管新生的关键进程,包括血管生成因子的分泌、基底膜降解、细胞外基质重塑、内皮细胞增殖迁移和周细胞的招募。Bmal1-/-小鼠中MMP-2与MMP-9表达增高,进而促进基底膜降解与ECM重塑。过表达Bmal1可通过调控VEGF活性,促进内皮细胞血管生成的能力,敲降VEGF表达逆转了Bmal1的促血管新生作用[13]。综上,生物节律影响着脑梗死发生,发展及预后,其关键分子在脑梗死后的血管新生发挥不可替代的作用。

阴阳学说是研究事物发生发展及其运动变化规律的学说,属中国古代哲学范畴。阴阳交感、对立、互根、消长以及转化,是人体生理活动及病理变化的规律和基本法则。自然界的昼夜变化之间,阴阳在不断地进行节律性的交替转化,人体的生理活动随着昼夜变化发生相应变化,影响着人体内的阴阳平衡[14]。《杂病广要》记载:“夫中风者,皆因阴阳不调,脏腑气偏,荣卫失度”,指出阴阳失衡是脑缺血疾病发生的根本,恢复脏腑功能,调节荣卫之司为诊治中风的关键。其中精、血、津液属阴,气属阳,“阴在内,阳之守也;阳在外,阴之使也”,即达到人体阴阳动态平衡。研究团队根据多年研究,在脑藏象理论的指导下,提出荣气为精、气、血、津液等精微物质的总称,各种成分相互依存,平衡转化,是维持生命健康的重要条件[15],当脑缺血疾病发生后,阴阳失调,荣气中精微物质的消长转化受限,致使加重荣气虚滞,精微物质匮乏致滋养不足,荣气之荣养、化变、成形功能障碍,新生血管受限[16],抑制脑梗死后血管新生进程,而活血荣络方可有效调和阴阳,促进荣气之荣养、化变、成形功能。故阴阳平衡理论及荣气虚滞理论对诊治脑梗死具有较高的临床指导意义。

本研究中,我们利用研究成熟的ECD及MCAO大鼠模型,进一步探索活血荣络方调节脑梗死后阴阳平衡,促进脑梗死后血管新生的现代科学内涵。研究结果显示,生物节律紊乱的大鼠精神状态欠佳,毛发质量低,Bmal1-/-小鼠新生星形胶质细胞数量明显减少,影响胶质细胞功能,Bmal1及Per1在缺血后,表达水平于急性期先升高,后缓慢下降[17]。急性脑梗死发生后,机体可发生代偿作用,相关促血管新生蛋白可明显升高,如VEGF、MMP-2等,结合本实验结果,发生脑梗后,相同时相的核心钟基因,如具有促血管新生能力的Bmal1及Per1表达量与MCAO大鼠相比明显下降,振荡幅度下降,表明Bmal1及Per1蛋白在MCAO大鼠模型中,可能发挥一定程度的保护作用。予以活血荣络方干预各组模型大鼠后,生物节律蛋白Bmal1及Per1 的表达量升高,提示活血荣络方促进脑梗死后血管新生可能与调节生物节律,上调生物钟关键蛋白相关。进一步研究发现,生物节律紊乱加重了脑梗死大鼠的神经功能缺损症状,而活血荣络方可逆转该加重过程,随着给药时间延长,效果越明显。HE染色显示,生物节律紊乱加重脑梗死后的病理损伤程度,活血荣络方有效减轻该病理损伤。ECs特异性表达CD34,是新生血管的重要标记物,我们发现,与脑梗死大鼠相比,脑梗死后生物节律紊乱大鼠海马区与皮质区中的CD34阳性细胞数明显下降,而活血荣络方给药组对上述两组模型发挥着明显的促CD34阳性细胞表达的作用。Western blot结果显示,生物节律紊乱降低脑梗死大鼠脑组织的血管新生关键蛋白表达,包括VEGF、MMP-2及MMP-9蛋白,给予活血荣络方可明显升高各组VEGF、MMP-2及MMP-9蛋白表达量。提示生物节律紊乱可加重脑梗死损伤程度,抑制脑梗死后神经功能恢复,限制血管新生,给予活血荣络方后可有效减轻生物节律紊乱诱导加重神经功能缺损,病理损伤,并可进一步促进血管新生进程。

众所周知,褪黑激素的分泌在中央和外围时钟同步运作的昼夜节律中发挥关键作用,通过调节VEGF的表达控制血管生成。本次研究中,生物节律紊乱对血清VEGF和褪黑激素表现出明显的抑制作用,给予活血荣络方则可有效升高二者表达,达到促进血管新生的作用。不仅如此,炎症因子可影响内皮细胞的增殖和迁移[18],与脑梗死大鼠相比,脑梗死后生物节律紊乱大鼠的炎症因子明显增加,各给药组的炎症因子与模型比较明显下降,我们推测炎症因子在脑组织的过度分泌可加重脑梗死大鼠神经系统损伤和血管生成受损,给药组在调节促进与抑制血管新生因子分泌的动态平衡过程中发挥重要作用。

昼夜节律和血管生成调节了哺乳动物生理和病理的大部分过程。越来越多的证据表明,昼夜节律和血管生成之间的相互作用,卒中后恢复状态中的各种状态揭示了节律性血管生成与卒中之间的直接相互作用。综上所述,生物节律加重脑梗死后损伤程度,减少新生血管阳性细胞数,而活血荣络方可有效调节生物节律核心蛋白表达,促进血管新生,为进一步中医药防治缺血性脑卒中提供了实验基础,丰富现代科学内涵。