蟹肉酶解物的鲜味物质分析及鲜味肽的鉴定

温泽华，杨璨，黄玉荣，于家乐，苏琦，李晓，金艳，张民

（天津科技大学 食品科学与工程学院，天津 300457）

中华绒螯蟹属于甲壳纲，是我国重要的经济水产养殖物种。长江流域是中华绒螯蟹的主要产区，其中以苏州阳澄湖最为著名，具有极高的商业价值[1]。中华绒螯蟹因生长迅速、风味鲜美、营养价值高而深受消费者的欢迎和喜爱，但蟹的贮藏和风味保持是影响其流通消费的重要因素。目前对于蟹的研究主要集中在蛋白质、肽和壳提取物的抗菌、抗肿瘤和免疫调节等[2]，近几年虽对中华绒螯蟹营养和风味研究有所增加[3-5]，但对其风味特性变化机理、鲜味物质鉴定等方面研究相对较少。

食品的风味是由气味、滋味和三叉神经特征相结合的一种复杂感觉，它是食品感官特性的主要组成部分之一，影响着消费者对食品的接受程度[6]。鲜味是除酸、甜、苦、咸之外的第五种基本味道，是水产品的主要特征味道，也是评价水产品品质的重要指标[7]。鲜味物质之间存在协同作用，可以用作鲜味增强剂以改善产品整体口感和感官品质[8]。水产品被认为是典型鲜味化合物的良好来源，其鲜味物质主要包括游离氨基酸、核苷酸、有机酸、肽及其衍生物或反应产物等[9-12]。鲜味肽及其衍生物作为一种理想的天然产品，是获得高质量产品不可或缺的元素[13]，目前已从鱼肉[12]、贝肉[14]、沙蟹汁[15]中鉴定出鲜味肽。

中华绒螯蟹鲜味物质丰富，可以作为开发优质鲜味食品添加剂的基础。因此，本研究以中华绒螯蟹蟹肉为原料，研究不同蛋白酶对蟹肉的酶解效果，通过风味分析、分离纯化、结构鉴定和鲜味预测，获得新型蟹源鲜味肽，以期为鲜味调味品的研究和应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

中华绒螯蟹：产自江苏省苏州市阳澄湖；木瓜蛋白酶（1×105U/g）、胰蛋白酶（1×105U/g）、复合风味酶（1×105U/g）、中性蛋白酶（2×105U/g）、碱性蛋白酶（1×105U/g）（均为食品级）：南宁东恒华道生物科技有限责任公司；胃蛋白酶（1.2×103U/g）（食品级）：厦门墨奕怀食品贸易有限公司；甲醇、乙腈（均为色谱纯）：国药集团化学试剂有限公司；5'-单磷酸腺苷（5'-adenosine monophosphate，5'-AMP）、5'-单磷酸鸟苷（5'-guanosine monophosphate，5'-GMP）、5'-单磷酸肌苷（5'-inosine monophosphate，5'-IMP）（均为标准品）：坛墨质检标准物质中心；乳酸、琥珀酸、细胞色素C、甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸、抑肽酶、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸、杆菌肽（均为标准品）：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；Sephadex G-15 葡聚糖凝胶：上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

pH 计（DHSJ-3F）：上海仪电科学仪器股份有限公司；数显式电热恒温水浴锅（XMTD-204）：天津市欧诺仪器仪表有限公司；电热鼓风干燥箱（GZX-9070MBE）：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；离心机（TDZ5-WS）：湖南湘仪离心机仪器有限公司；自动凯氏定氮仪（K9840）：山东海能科学仪器有限公司；酶标仪（Synergy HTX）：美国伯腾仪器有限公司；真空冷冻干燥机（MODULYOD-230）、质谱仪（Q Exactive）：赛默飞世尔科技公司；高效液相色谱仪（SPD-20A）、气相色谱质谱联用仪（GCMS-QP2010 Ultral）：日本岛津公司；氨基酸分析仪（Biochrom30+）：英国Biochrom 公司；定时数显恒流泵（HL-2D）、自动部份收集器（BS-100A）：上海沪西分析仪器厂有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蟹肉酶解液的制备

将中华绒螯蟹洗净，在冰浴条件下剥离和收集体肉，加热变性10 min 后，分别选用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、复合风味酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶对蟹肉进行酶解。酶解条件为蟹肉与水质量比1 ∶6、酶添加量4 500 U/g、酶底比4.4%、酶解时间4 h，酶解温度和pH 值分别根据各酶的最适条件进行设定。酶解后于100 ℃灭酶10 min，以3 500 r/min 离心20 min 收集上清液，经真空冷冻干燥后得到蟹肉酶解物。

1.3.2 水解度的测定

分别采用凯氏定氮法和甲醛滴定法测定样品酶解液中总氮含量[16]和氨基态氮含量[17]，水解度为氨基态氮含量占总氮含量的百分比。

1.3.3 感官评定

选取经过感官培训的10 名感官评定人员，分别从鲜味、甜味、咸味、酸味、苦味、不良风味、蟹类特有腥香气、浓厚感、整体口感和余后感10 个方面对各酶解物样品进行感官评价，评分标准见表1。

表1 感官评定标准Table 1 Sensory evaluation criteria

1.3.4 挥发性风味物质的测定

称取适量酶解物置于20 mL 顶空瓶内，通过顶空固相微萃取技术对样品中的挥发性物质进行吸附收集，通过气相色谱质谱联用技术对其进行鉴定和分析。色谱条件：Rtx-5MS 色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；柱流量为1.0 mL/min。柱温箱起始温度40 ℃，保持3 min 后，以4 ℃/min 升温到150 ℃保持1 min，再以8 ℃/min 升温到250 ℃保持6 min。质谱条件：电子轰击（electron impact，EI）离子源（200 ℃）；质量扫描范围m/z 35～500。

1.3.5 游离氨基酸的测定

向酶解物中加入5.0%磺基水杨酸沉淀蛋白，以18 000 r/min 离心30 min 后取上清液，经0.22 μm 滤膜过滤后，采用氨基酸分析仪进行测定。色谱柱：4.6 mm×200 mm；缓冲盐系统为钠盐；缓冲液流速0.2 mL/min；脯氨酸的检测波长为440 nm，其他氨基酸的检测波长为570 nm。

1.3.6 呈味核苷酸的测定

参考吕丽等[18]的方法并稍作修改。酶解物经0.45 μm滤膜过滤后，采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法进行测定。HPLC 条件：安捷伦C18 色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；柱温30 ℃；流速0.6 mL/min；进样量20 μL；检测波长254 nm。流动相A 为0.02 mol/L 的KH2PO4，pH4.6，流动相B 为甲醇，流动相A 与流动相B 以97 ∶3 的体积比等度洗脱。在相同条件下以标准品的保留时间进行定性分析，并绘制各浓度梯度混标的标准曲线，进行定量分析。

1.3.7 有机酸的测定

参考GB 5009.157—2016《食品安全国家标准食品中有机酸的测定》[19]并稍作修改。酶解物经0.45 μm 滤膜过滤后，采用高效液相色谱法进行测定。HPLC 条件：安捷伦C18 色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；柱温40 ℃；流速0.8 mL/min；进样量20 μL；检测波长210 nm。流动相A 为0.1%磷酸溶液，流动相B 为甲醇，流动相A 与流动相B 以97.5 ∶2.5 的体积比等度洗脱。在相同条件下以标准品的保留时间进行定性分析，并绘制各浓度梯度混标的标准曲线，进行定量分析。

1.3.8 肽含量的测定

用牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）配制成标准溶液，并对其进行梯度稀释，取40 μL 各浓度标液和160 μL 双缩脲试剂加入96 微孔板，以等体积蒸馏水代替标液作空白对照，室温下放置30 min，于540 nm处测吸光度，绘制标准曲线。以相同方法得到酶解物在540 nm 处的吸光度，计算得到多肽含量。

1.3.9 肽分子量分布的测定

参考黄煜燃等[20]的方法并稍作修改。酶解物经0.45 μm 滤膜过滤，采用高效液相色谱法进行测定。HPLC 条件：TSK-gel 2000 SWXL 色谱柱（7.8 mm×30 cm）；柱温30 ℃；流速0.5 mL/min；进样量20 μL；检测波长214 nm。流动相为乙腈-水溶液（体积比2 ∶8，添加0.1%三氟乙酸），等度洗脱。在相同条件下以各标准品保留时间和相对分子质量对数作线性回归，标准品的保留时间和相对分子质量关系如表2 所示，通过峰面积计算得到酶解物中不同相对分子质量范围肽的含量。

表2 标准品的保留时间和相对分子质量关系Table 2 Relationship between retention time and relative molecular weight of standards

1.3.10 肽的超滤分离

将酶解物置于截留分子量10 kDa 的超滤管中，于4 ℃下以5 000 r/min 离心20 min，将透过液置于截留分子量3 kDa 的超滤管中重复上述操作，分别收集10 kDa 截留液、3 kDa 截留液和3 kDa 透过液，进行描述性感官评价。

1.3.11 肽的凝胶层析分离

Sephadex G-15 凝胶经水溶胀后填装于1.6 cm×60 cm 的层析柱中，配制成25 mg/mL 超滤组分溶液，经0.45 μm 滤膜过滤后进行凝胶层析分离，用超纯水进行洗脱，流速为0.5 mL/min，上样量1 mL。收集各洗脱峰，经浓缩、冷冻干燥后保存备用。

1.3.12 肽的结构鉴定

将描述性感官评价最好的层析组分经脱盐处理后进行高效液相色谱串联质谱分析，并通过MaxQuant 1.5.5.1 检索数据库解析肽序列。色谱分离条件（0.15 mm×150 mm，RP-C18）：流动相A 为0.1%甲酸水溶液，流动相B 为0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈为84%），液相梯度设置为0～50 min，4%～50%B；50～54 min，50%～100%B；54～60 min，100%B。质谱条件为检测方式：正离子；分析时长：60 min；多肽和多肽碎片的质量电荷比采集方法为MS2 scan 扫描模式，每次全扫描后采集10 个碎片图谱。

1.3.13 蟹肉鲜味肽的预测筛选

根据质谱鉴定结果，筛选出具有潜在鲜味特性的蟹肉肽，利用BIOPEP-UWM（http：//www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/pl/biopep）中的Sensory peptides and amino acids 模块预测肽的潜在鲜味特性[21]，并利用Pep-Draw（http：//pepdraw.com/）[22]和网站http：//www.innovagen.com/proteomics-tools[21]对所选鲜味肽的物理化学特性和水溶性进行预测。

1.4 数据处理

试验结果采用IBM SPSS Statistics 22 软件对数据进行显著性差异分析，以P<0.05 为显著性检验标准，结果以平均值±标准差表示，采用Origin 2017 和Graph Pad Prism 8.0.2 进行作图。

2 结果与分析

2.1 不同蛋白酶对蟹肉酶解物水解度和口感的影响

不同蛋白酶对蟹肉酶解物水解度的影响见图1。

图1 不同蛋白酶对蟹肉水解度的影响Fig.1 Effect of different proteases on the degree of hydrolysis of crab meat

由图1 可知，不同蛋白酶对蟹肉的酶解程度影响差异较大。这是由于不同蛋白酶对底物的作用位点和水解方式不同，使得酶解的程度和效果有所差异。其中，胰蛋白酶对中华绒螯蟹蟹肉的酶解效果最好，水解度为（51.99±1.85）%，显著高于其它蛋白酶酶解的水解度。目前蟹肉蛋白质序列并未明确，本结果表明胰蛋白酶的酶解特异性可能使得蟹肉蛋白中大量氨基酸和肽游离出来，因此水解度较高。

酶解是提取风味物质及其前体的有效方法[23]，酶解物的感官评价结果如图2 所示。

图2 不同蛋白酶对蟹肉酶解物感官评价的影响Fig.2 Effect of different proteases on sensory evaluation of crab meat hydrolysates

由图2 可知，胰蛋白酶酶解物的鲜味、浓厚感、整体口感和蟹类特有腥香气均最强，苦味较弱。这是由于胰蛋白酶是内切酶，能特异性切割精氨酸和赖氨酸羧基端肽键[24]，使得酶解液中碱性氨基酸多位于C 末端，因此鲜味增强，苦味较轻。由于胰蛋白酶酶解中华绒螯蟹蟹肉的水解度最高，酶解液的鲜味、浓厚感、整体口感和蟹类特有腥香气最强，苦味和咸味较弱。因此，选择胰蛋白酶为酶解中华绒螯蟹蟹肉的最优酶。

2.2 蟹肉胰蛋白酶酶解物中的风味物质分析结果

为解析蟹肉胰蛋白酶酶解物中的风味物质，对样品中肽、游离氨基酸、核苷酸、有机酸和挥发性风味物质含量进行测定。蟹肉酶解物中挥发性风味物质的含量如表3 所示。

表3 蟹肉酶解物中挥发性风味物质的含量Table 3 Content of volatile flavor compounds in crab meat hydrolysates

由表3 可知，酶解物中共检出23 种挥发性风味物质，其中烃类化合物种类最多，相对含量占比最高，可能是由于脂肪酸受热裂解产生大量碳氢类物质所致。十七烷被认为是使鱼类和藻类呈现香气的重要物质，可能是酶解物腥香气产生的重要来源。反式角鲨烯具有轻微令人愉快的气味，2，4-二甲基苯甲醛具有温和清甜的苦杏仁气味，月桂醇具有弱而持久的油脂气味，香叶基丙酮具有清甜香、微玫瑰香，苯并噻唑具有似喹啉气味，吡啶具有鱼样香气，它们对酶解物香气的形成都有一定的贡献。

双缩脲法测定结果表明蟹肉酶解物中肽含量为（56.51±1.56）%，其分子量分布情况如表4 所示。

表4 酶解物的肽分子量分布Table 4 Peptide molecular weight distribution of hydrolysates

由表4 可知，胰蛋白酶酶解物中大部分是分子量在1 500 Da 以下的肽。多肽的链长及分子量大小直接影响其风味特性。有研究发现海鲜提取物中分子量在1 500 Da 以下的长肽链具有良好的呈鲜特性[25]。因此，肽是蟹肉酶解物中的主要呈鲜物质。

游离氨基酸结果如表5 所示。

表5 蟹肉酶解物中游离氨基酸的含量Table 5 Content of free amino acids in the hydrolysate of crab meat

由表5 可知，17 种氨基酸在蟹肉酶解物中均有检出，总含量为270.81 mg/g，与前述水解度结果较为符合。酶解物中精氨酸含量最高，有文献表明精氨酸在海产品中大量存在，可能是海产品特殊良好风味的来源[26]。谷氨酸和天冬氨酸在蟹肉酶解物中含量分别为8.07 mg/g 和3.84 mg/g。酶解物中甜味氨基酸的含量丰富，对鲜味有增强作用，尤其是丙氨酸、甘氨酸和脯氨酸。此外，部分含量较低的苦味氨基酸也能增强酶解物的鲜甜味，对酶解物的风味有一定贡献。酶解物中所有氨基酸含量均高于其呈味阈值，滋味活性值（taste activity value，TAV）均大于1，说明17 种氨基酸对酶解物的鲜味都有直接贡献作用。

核苷酸是重要的呈鲜物质，其中5'-AMP、5'-GMP和5'-IMP 是水产品中重要的鲜味成分。蟹肉胰蛋白酶酶解物中呈味核苷酸的含量如表6 所示。

表6 蟹肉酶解物中呈味核苷酸的含量Table 6 Content of flavor nucleotides in crab meat hydrolysates

由表6 可知，5'-GMP、5'-IMP 和5'-AMP 均有检出，其中5'-IMP 含量最高，说明5'-IMP 是样品中的主要特征呈味核苷酸。类似的，郭亚男等[27]发现养殖三疣梭子蟹肌肉中IMP 和AMP 含量丰富，刘天天[28]发现IMP 和GMP 对沙蟹蟹肉和沙蟹汁鲜味有直接贡献。酶解物中3 种核苷酸含量均高于其呈味阈值，TAV 均大于1，说明3 种核苷酸对酶解物的鲜味都有直接贡献作用，可增强酶解物鲜味。

乳酸、琥珀酸及其钠盐是主要的有机酸鲜味物质，在许多水产养殖品种中被检出，是甲壳类水产品中主要的肌肉代谢产物，能对产品呈鲜起到辅助作用[29]。Yang 等[30]发现河豚肉中乳酸是主要的有机酸鲜味物质，使得河豚具有特殊的味觉特性。蟹肉胰蛋白酶酶解物中有机酸的含量如表7 所示。

表7 蟹肉酶解物中有机酸的含量Table 7 Organic acid content in crab meat hydrolysates

由表7 可知，乳酸和琥珀酸均有检出，琥珀酸对鲜味有主要贡献作用。酶解物中乳酸和琥珀酸含量丰富且高于呈味阈值，TAV 均大于1，说明乳酸和琥珀酸对酶解物的鲜味有直接贡献作用，可增强酶解物鲜味。这与刘天天[28]和司蕊[14]的研究结果一致。

2.3 蟹肉肽的分离与纯化

将蟹肉胰蛋白酶酶解物经超滤分离，得到分子量分别为＞10 kDa、3～10 kDa 和＜3 kDa 的超滤组分，3 个组分的描述性感官评价结果见表8。

表8 酶解物超滤组分的描述性感官评价Table 8 Descriptive sensory evaluation of ultrafiltration components of hydrolysates

由表8 可知，分子量小于3 kDa 的组分鲜味强度更高，甜味也要比分子量大于3 kDa 的组分强，说明主要的鲜味及增鲜物质集中在分子量小于3 kDa 组分。因此，选择分子量3 kDa 以下的各样品组分进行凝胶层析分离。

对酶解物分子量3 kDa 以下组分进行凝胶层析分离，得到5 个组分，色谱图如图3 所示，5 个层析组分的描述性感官评价见表9。

表9 酶解物层析组分的描述性感官评价Table 9 Description and sensory evaluation of hydrolysate chromatographic components

由表9 可知，组分3 的鲜味强度更高，说明主要的鲜味及增鲜物质集中在组分3 中。因此，选择组分3 进行下一步的氨基酸序列鉴定。

2.4 蟹肉鲜味肽的鉴定与筛选

通过高效液相色谱串联质谱技术对组分3 中蟹肉鲜味肽进行鉴定和解析，得到381 条多肽。氨基酸的组成和排列位置是影响鲜味的重要因素，研究表明谷氨酸和天冬氨酸是鲜味肽最主要的组成氨基酸，丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸和丝氨酸作为甜味氨基酸，可以通过与谷氨酸及天冬氨酸协同作用产生鲜味[25]。鲜味肽一般同时含有碱性和酸性基团，且C 末端是碱性氨基酸时显示出更高的鲜味强度[31]，阮仕艳[32]从罗非鱼下颌中筛选出了VADLMR、STELFK、DALKKK、FVGLQER、VVLNPVARVE 5 个肽段。疏水性氨基酸，如亮氨酸、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸的存在有助于多肽鲜味的呈现[32]。据此，从381 条多肽中筛选出14 条含有谷氨酸或天冬氨酸，同时碱性基团在C 末端且分子量小于1 000 Da 的肽段。这些多肽的序列长度在8～10 个氨基酸之间，分子量分布范围为795.42～981.55 Da，理化性质预测如表10 所示。

表10 多肽的氨基酸序列及理化性质预测Table 10 Prediction of amino acid sequence and physicochemical properties of polypeptides

由表10 可知，14 条多肽均具有良好的水溶性。

利用BIOPEP-UWM 对14 条多肽的潜在鲜味特性进行预测，结果如表11 所示。

表11 多肽的氨基酸序列及鲜味特性预测Table 11 Prediction of amino acid sequences and flavor characteristics of polypeptides

由表11 可知，鉴定筛选出的14 条多肽中，AGFAGDDAPR 可在BIOPEP-UWM 数据库中检索到，它既是鲜味肽、甜味肽又是浓厚感肽，二级质谱解析图见图4。m/z 为489.23 的主要碎片离子包括y1（175.119）、y2（272.171 7）、y3（343.208 8）、y4（458.235 8）、y5（573.262 7）、y6（630.284 2）、y7（701.321 3）、y8（848.389 7）、y9（905.411 2）、b2（129.065 9）、b3（276.134 3）。

图4 AGFAGDDAPR 的二级质谱解析图Fig.4 Resolution diagram of AGFAGDDAPR secondary mass spectrum

由图4 可知，除AGFAGDDAPR 外的其它13 条多肽未在BIOPEP-UWM 数据库中检索到，且多肽中部分片段与BIOPEP-UWM 数据库已报道的鲜味片段相匹配，说明这些是潜在的新型鲜味肽。鲜味氨基酸片段的出现频率可以预测多肽呈鲜的潜在可能，其中，VDQIGEGGR 和LTEAPLNPK 含有较多的鲜味片段，可能有更强的鲜味。

3 结论

本研究结果表明，胰蛋白酶是酶解中华绒螯蟹蟹肉的最适酶，且所得酶解物具有丰富的鲜味物质，多肽含量为（56.51±1.56）%，谷氨酸含量为8.07 mg/g，IMP含量（573.91±21.31）mg/100 g，琥珀酸含量为（1 216.50±68.44）mg/100 g。经超滤和凝胶层析分离、质谱鉴定、数据库筛选得到14 条具有潜在鲜味特性的小分子肽，其中AGFAGDDAPR 为已报道的鲜味、甜味和浓厚感肽，其余13 条是未报道过的，其中VDQIGEGGR 和LTEAPLNPK 含有最多的鲜味片段，可能具有更强的鲜味。综上，蟹肉中天然存在的特有的鲜美味道，可以作为研究新型海鲜产品的开发基础，酶解物产品较蟹肉存储便利、风味易于保持，产品货架期延长，有着较为广阔的市场前景。通过对其特征性鲜味肽的解析鉴定，为蟹高营养和高商业价值提供佐证，为新型调味品的研究和应用提供参考。