小菜蛾气味结合蛋白PxylOBP33与其相关信息化学物质的分子对接

付淑慧,张 鹤,赵婉清,梁志刚

(忻州师范学院生物系,山西忻州034000)

小菜蛾PlutellaxylostellaL.,属鳞翅目Lepidoptera菜蛾科Plutellidae,是一种世界性的农业害虫。该虫专一性取食白菜、油菜、甘蓝、萝卜、芥菜、花椰菜等十字花科蔬菜,严重时可使蔬菜减产90%以上,甚至绝收(Furlongetal., 2013; Lietal., 2016a)。多年来,小菜蛾的防治以化学防治为主,大量化学农药的使用导致小菜蛾发展为抗药性最严重的害虫之一。利用信息化学物质如寄主植物挥发物和性信息素监测和诱捕害虫,因其绿色高效而备受关注。目前,已明确寄主植物挥发物在小菜蛾的行为活动中发挥着重要的作用。如异硫氰酸酯类物质(Isothiocyanates,ITCs)是十字花科植物的特异性挥发物,可以显著影响小菜蛾的电生理反应、行为活动和产卵选择,是小菜蛾识别和定位十字花科植物的重要嗅觉信号(Renwicketal., 2006; Sunetal., 2009; Liuetal., 2020)。因此,基于信息化学物质探索和研究高效、无毒、无污染防治小菜蛾的新方法和新途径具有重要的科学意义和应用前景。

气味结合蛋白(odorant binding proteins, OBPs)是昆虫识别外界气味挥发物的第一步生化反应,在昆虫定位寄主植物、寻找配偶、选择合适产卵场所和躲避天敌等活动中发挥着重要的作用(Leal, 2013; Pelosietal., 2014; Rihanietal., 2021)。越来越多的研究表明,OBPs的沉默会导致昆虫对信息化学物质的电生理反应和行为反应下降(Chenetal., 2021; Liuetal., 2021)。研究OBPs和气味挥发物之间的关系,一方面可以阐明二者之间的结合机制,另一方面可以通过OBPs的结构特征设计调节昆虫行为的活性挥发物。常用的研究方法为荧光竞争结合技术,通过原核表达、蛋白质纯化以及结合试验,从而明确蛋白质与气味挥发物二者的结合能力(彭竹等, 2020; 郭莉等, 2021)。然而,该过程繁琐,蛋白质存在变性的可能,且待测气味物质数量众多。

目前,从小菜蛾的基因组和转录组中鉴定到39个OBPs,这些基因的表达模式与性别、组织、发育阶段、交配状态和生存环境中有无寄主植物密切相关,其中,PxylOBP33在雌、雄虫触角中特异性表达,可能参与了小菜蛾识别信息化学物质的过程(Caietal., 2021)。为了探究PxylOBP33的功能,本研究拟对其进行同源建模,通过分子对接,模拟PxylOBP33与寄主植物挥发物、小菜蛾性信息素及其类似物的结合方式,初步解析PxylOBP33与信息化学物质的结合机制,以期明确PxylOBP33的潜在结合物质。

1 材料与方法

1.1 材料

序列来源:基于Caietal.(2021)文献报道,获得PxylOBP33氨基酸序列,NCBI中登录号为KAG7302154.1。

供试信息化学物质:选取小菜蛾的4种性信息素及其5种结构类似物和45种十字花科植物挥发物,共54种挥发物,用于PxylOBP33分子对接。其中,十字花科植物挥发物包括36种一般性气味挥发物和9种异硫氰酸酯类物质。

1.2 方法

1.2.1PxylOBP33的同源建模

使用SignalP 5.0(https://services.health tech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)预测PxylOBP33的信号肽位置,以删除信号肽的氨基酸序列为目标序列,在Swiss-model(https://www.swissmodel.expasy.org/)中搜寻同源建模的蛋白质模板。蛋白质模板综合考虑全球模型质量估算值(global model quality estimation,GMQE)、定性模型能量分析值(qualitative model energy analysis,QMEAN)以及模板与PxylOBP33的氨基酸序列一致性大于30%等条件。使用Clustal X在线软件(https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)比较PxylOBP33和蛋白质模板氨基酸序列的一致性,并通过ESPript 3.0网站(https://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi)对比对结果进行处理。蛋白质三维结构的显示和分析使用PyMOL软件。

1.2.2同源建模所得模型评价

为保证建模蛋白质的质量,使用SAVES 6.0软件(https://saves.mbi.ucla.edu/)中的ProCheck、Verify-3D和ERRAT三种程序对已构建的PxylOBP33三维模型进行评价。ProCheck程序是通过分析蛋白质氨基酸残基中二面角φ和ψ是否分布在合理范围内来评价蛋白质结构的立体化学质量,评价结果以拉式构象图(Ramachandran plot)呈现。拉氏构象图分为4个区域:最佳合理区、较合适区、勉强接受区和不合理区。若90%以上的氨基酸位于最佳合理区,则蛋白质模型可靠。Verify-3D程序通过确定蛋白质三维结构与一级结构之间的相溶性来评价结构与序列之间的匹配度,如果蛋白质三维结构与一级结构对应关系的得分大于0.2时,则认为该蛋白质模型合格。ERRAT程序能够统计碳、氮、氧3种类型原子之间形成的非共价键数目,其误差值在置信区间内的氨基酸数量占总氨基酸数量的比例为ERRAT值,若ERRAT值大于50%,即表示模型中非键合相互作用合理。

1.2.3分子对接

配体分子的准备:根据配体分子的CAS号或名称从PubChem网站(https://pubchem.ncbi. nlm.nih.gov/)下载其三维结构,利用Open-babel 3.0软件将配体的SDF格式转换为PDB格式后,通过AutoDock Tool 1.5.6软件使配体分子具有原子电荷以及力场,并储存为PDBQT格式。

蛋白质分子的准备:通过AutoDock Tool 1.5.6软件对已构建的PxylOBP33蛋白质添加氢键,合并蛋白质分子中的非极性氢,识别受体各原子类型,同时赋予原子电荷以及力场,最后储存为PDBQT格式文件。

分子对接:使用AutoDock Tool 1.5.6软件进行半柔性对接,在grid模块中设置受体与配体的结合搜寻空间Grid Box,坐标为x=-1.668,y=5.22,z=-11.518,网格参数为90点×90点×100点,格点间距为0.375 Å,每组输出10个对接结果,包括自由结合能和模型构象等信息。自由结合能低于-5.0 kJ/mol且位点构象合理的物质,即为PxylOBP33的潜在结合物质,最后使用Discovery Studio 4.5软件分析该物质与PxylOBP33的对接结果。

2 结果与分析

2.1 PxylOBP33同源建模结果

PxylOBP33编码143个氨基酸,N端含有22个氨基酸长度的信号肽。去除PxylOBP33信号肽,通过Swiss-model搜索其同源蛋白质,结果显示冈比亚按蚊AnophelesgambiaeAgamOBP20(ID:3V2L)与PxylOBP33的氨基酸覆盖率为80%,同源性为35.29%,GMQE值为0.78,QMEAN值为-0.56,均符合同源建模的要求,故以AgamOBP20为模板构建小菜蛾PxylOBP33的三维结构。

PxylOBP33与AgamOBP20的氨基酸比对结果显示(图1),二者具有较好的一致性,均含有6个半胱氨酸残基,形成3对二硫键,属于典型的昆虫OBPs。PxylOBP33与AgamOBP20的三维结构比对结果显示(图2-A,C),这两种蛋白质的主要结构区域基本重合,均方根误差(Root mean squared error,RMSD)值为0.079。PxylOBP33为球状蛋白质(图2-B),由6个α螺旋组成,分别为α1(Arg3-Asn21)、α2(Glu25-Lys33)、α3(Arg40-Met52)、α4(Tyr63-Met73)、α5(Pro76-Lys88)和α6(Leu99-Asp112),存在3对二硫键:Cys17-Cys48,Cys44-Cys100和Cys89-Cys109,分别连接α1和α3、α3和α6以及α5和α6。

图1 小菜蛾气味结合蛋白PxylOBP33与蛋白质模板AgamOBP20的序列比对

图2 小菜蛾气味结合蛋白PxylOBP33的三维模型

2.2 PxylOBP33三维结构模型的质量评价

通过ProCheck程序分析PxylOBP33三维模型的立体化学质量,拉式构象图显示(图3)PxylOBP33中91.8%的氨基酸残基落在最佳合理区,8.2%的氨基酸残基落在较合适区,无氨基酸落在勉强接受区和不合理区,符合拉式构象图中氨基酸位于最佳合理区的数量大于90%的标准。因此,PxylOBP33三维模型的立体化学质量良好。

图3 小菜蛾气味结合蛋白PxylOBP33模型的拉氏构象图

通过Verify-3D程序评价PxylOBP33三维结构模型和一级结构之间的关系,构象中100%的氨基酸评分大于0.2(图4),表明PxylOBP33三维模型的氨基酸残基是合理的。

图4 小菜蛾气味结合蛋白PxylOBP33模型的Verify-3D得分结果

通过ERRAT程序评价目标构象中不同原子之间非键相互作用的整体性能。PxylOBP33三维结构模型的ERRAT值为97.3214%(图5),远大于一般要求50%,表明建模蛋白质的非共价键相互作用整体上是合理的。综合以上评价结果,PxylOBP33三维结构模型合理,可用于分子对接。

图5 ERRAT计算的小菜蛾气味结合蛋白PxylOBP33模型残基误差值

2.3 分子对接

2.3.1PxylOBP33与一般性植物挥发物的对接结果

分子对接显示PxylOBP33与36种一般性植物挥发物的自由结合能在-6.29～-3.56 kJ/mol之间(表1)。自由结合能数值越小代表蛋白质与配体的结合能力越强,本研究以自由结合能低于-5.0 kJ/mol且位点构象合理的物质为PxylOBP33潜在结合物质,因此共18种一般性挥发物与PxylOBP33有结合能力,包括2种醛(苯甲醛和苯乙醛)、2种酮(苯乙酮和甲基庚烯酮)、5种酯(顺-3-己烯异戊酸酯、乙酸苯甲酯、水杨酸甲酯、顺-3-丙酸己烯酯和顺-3-己烯醇乙酸酯)和9种萜烯类物质(D-柠檬烯、α-松油烯、罗勒烯、桉树脑、里那醇、莰烯、α-蒎烯、月桂烯和香叶醇)。其中,D-柠檬烯与PxylOBP33结合能力最强,自由结合能为-6.29 kJ/mol。D-柠檬烯为环状小分子物质,与PxylOBP33结合时,位于PxylOBP33的结合腔内,二者主要通过疏水作用和范德华力结合(图6)。D-柠檬烯与PxylOBP33的氨基酸Pro81(4.38 Å)、Ala85(3.58 Å)、Met110(4.62 Å)、Phe120(5.20 Å)和Phe118(4.33、5.16、5.45 Å)形成疏水作用力,与氨基酸Tyr50、Thr82、Val113、Asp114、Asn117和Val119形成范德华力。除疏水作用和范德华力两种分子间作用力外,PxylOBP33与12种配体可以形成氢键,维持蛋白质-配体之间的稳定。如PxylOBP33的Thr82、Val119与顺-3-己烯异戊酸酯,Tyr50、Phe118与乙酸苯甲酯,Val119与苯乙酮,Val119与里那醇,Tyr50、Val119与水杨酸甲酯之间存在氢键,其中Tyr50和Val119是PxylOBP33与这些配体物质形成氢键的重要氨基酸。

表1 小菜蛾气味结合蛋白PxylOBP33与一般性挥发物的分子对接

图6 小菜蛾PxylOBP33与D-柠檬烯的分子对接图

2.3.2PxylOBP33与十字花科植物特异性挥发物的对接结果

通过分子对接检测了PxylOBP33与十字花科植物特异性挥发物——异硫氰酸酯类物质的结合能力。在9种异硫氰酸酯类物质中,PxylOBP33与4种物质具有结合能力,分别为异硫氰酸苯乙酯(-6.27 kJ/mol)、异硫氰酸苯酯(-6.15 kJ/mol)、对甲氧异硫氰酸苯酯(-5.81 kJ/mol)和异硫氰酸苄酯(-5.67 kJ/mol)(表2)。这4种物质主要通过疏水作用、范德华力以及π-硫静电作用与PxylOBP33结合。其中,异硫氰酸苯乙酯与PxylOBP33的结合能力最强,二者通过氢键、疏水作用、范德华力以及π-硫静电作用这些分子间作用力结合(图7)。PxylOBP33的氨基酸Val119与异硫氰酸苯乙酯形成氢键,键长2.95 Å,氨基酸Pro81(4.46Å)、Ala85(4.67Å)、Met110(5.12Å)与异硫氰酸苯乙酯存在疏水作用,Val13、Asp14、Tyr50、Phe74、Thr82、Asn117、Phe118、Pro121是范德华力的位点,Phe120(4.73 Å)是π-硫静电作用的关键位点。由于异硫氰酸酯类物质是一类含硫的化学物质,π-硫静电作用可能是PxylOBP33与该类物质结合区别于其他物质的分子间作用力。

表2 小菜蛾气味结合蛋白PxylOBP33与十字花科特异性挥发物的分子对接

图7 小菜蛾PxylOBP33与异硫氰酸苯乙酯的分子对接图

2.3.3PxylOBP33与性信息素成分及其类似物的对接结果

小菜蛾PxylOBP33与4种性信息素成分及其5种类似物的自由结合能在-6.96～-5.69 kJ/mol之间(表3),均有较强的结合能力。小菜蛾主要性信息素成分之一的顺-11-十六碳烯乙酸酯(Z11-16∶Ac)与PxylOBP33的结合能力最强,自由结合能为-6.96 kJ/mol。Z11-16∶Ac与PxylOBP33结合时,位于PxylOBP33的结合空腔内,主要通过疏水作用和范德华力结合,疏水作用的氨基酸位点为Leu6(4.48 Å)、Pro121(4.42 Å),范德华力的作用位点为Gly10、Met13、Tyr50、Ser52、Leu55、Val70、Met73、Phe74、Pro81、Thr82、Ala85、Met110、Val113、Asp114、Asn117、Phe118、Val119、Phe120(图8)。另一小菜蛾主要性信息素顺-11-十六碳烯醛(Z11-16∶Ald)与PxylOBP33的自由结合能为-6.04 kJ/mol,通过疏水作用和范德华力结合。其余性信息素及其类似物除具有疏水作用和范德华力外,还通过氢键与PxylOBP33结合。

表3 小菜蛾气味结合蛋白PxylOBP33与性信息素及其类似物的分子对接

图8 小菜蛾PxylOBP33与顺-11-十六碳烯乙酸酯的分子对接图

3 结论与讨论

昆虫依赖灵敏的嗅觉系统识别外界的信息化学物质,进而觅食、求偶、交配、繁殖和避险等。在识别气味分子的过程中,OBPs作为嗅觉反应的第一步,首先与气味物质进行识别、结合和转运。在成虫触角中表达的OBPs能够结合各类信息化学物质。本研究选取了在触角中高表达的小菜蛾PxylOBP33,通过同源建模和分子对接,明确其结合物质和结合能力,从而获得了该蛋白质的潜在结合物质。

由于小菜蛾是十字花科蔬菜的专食性害虫,因此本研究选取小菜蛾嗜食寄主植物白菜、甘蓝、油菜、萝卜的气味挥发物与PxylOBP33进行分子对接。结果发现,PxylOBP33能与22种寄主植物挥发物结合,包括2种醛、2种酮、9种酯和9种萜烯类物质(表1和表2)。这与OBPs可以结合多种具有不同化学基团的气味物质的结果相吻合(李广伟等, 2017; Yuetal., 2018; 孙小洁等, 2020)。化学物质本身的性质会影响OBPs的结合能力。在一定范围内,气味挥发物碳原子数目的增加会导致OBPs与配体分子的结合能力减弱(Jiangetal., 2009; Dengetal., 2012),也有研究认为蛋白质结合能力的强弱与配体碳原子的数目无显著关系(Lietal., 2016b)。本试验中,PxylOBP33结合的化学物质,除异硫氰酸苯酯(C7)和苯甲醛(C7)含有7个碳原子外,其余物质碳原子数目在8个以上。虽然PxylOBP33的结合能力并不随着配体碳原子数目的增加而增加,但该蛋白质与碳原子数目多的配体结合能力强,这可能与碳原子数目多的配体形成作用方式的构象所占空间大有关。此外,有研究显示配体的形状也会影响OBPs的结合能力。云斑天牛BatocerahorsfieldiBhorOBPm2与链状配体的结合能力强于环状配体(Zhengetal., 2016),而有的研究认为OBPs对环状配体的结合能力强于链状配体(郭莉等, 2021)。小菜蛾PxylOBP33能与17种链状配体结合,同时,与14种环状配体有较强的结合能力,该蛋白质结合能力不受配体形状的影响。

OBPs与配体物质有效结合依赖蛋白质的氨基酸和配体形成的相互作用力。PxylOBP33与配体之间通过疏水作用、范德华力和氢键等结合,符合OBPs这种转运蛋白的特性,即通过蛋白质构象的改变,结合和释放配体分子,所以多以非共价相互作用力与配体分子结合,便于后续配体分子的释放。异色瓢虫Harmoniaaxyridis4种OBPs(Quetal., 2022)、花椒窄吉丁AgriluszanthoxylumiAzanOBP3(郭莉等, 2021)、花绒寄甲DastarcushelophoroidesDhelOBP21(Lietal., 2015)等与配体的结合也存在氢键、疏水作用和范德华力。然而,PxylOBP33与异硫氰酸酯类物质除上述三种作用力外,还存在π-硫键,该键本质上是一种静电作用力,这可能是这类物质与PxylOBP33结合的特殊方式,可在设计引诱剂或趋避剂时,考虑该作用方式。

本研究中,与PxylOBP33具有结合潜力的物质都是十字花科植物的主要成分,均能引起小菜蛾触角电生理反应或/和行为反应(Reddy and Guerrero, 2000; 韩宝瑜等, 2001)。顺-3-己烯醇乙酸酯、苯甲醛和苯乙醛是甘蓝、白菜和青菜3种十字花科蔬菜共有的挥发物(戴建青等, 2011),顺-3-己烯醇乙酸酯和苯甲醛能引起小菜蛾趋向行为反应(田厚军等, 2018),且顺-3-己烯醇乙酸酯对小菜蛾具有很强的引诱活性(王香萍等, 2005)。苯乙醛是开花植物释放的一种芳香型化合物,是许多鳞翅目昆虫的优质食物指示剂(Knauer and Schiestl, 2015; Guoetal., 2021)。而小菜蛾对α-松油烯、D-柠檬烯和里那醇在行为上有拒避以及产卵忌避反应(Zhangetal., 2004)。异硫氰酸酯类物质是十字花科植物的特异性挥发物,是小菜蛾寻找寄主植物和定位产卵场所的重要化学信号。本研究中,PxylOBP33与异硫氰酸苯乙酯、异硫氰酸苯酯、对甲氧异硫氰酸苯酯和异硫氰酸苄酯有较好的结合能力。已有研究表明,这4种物质都能刺激小菜蛾产卵,其中异硫氰酸苯乙酯对小菜蛾的触角电位反应最强烈,能显著刺激小菜蛾雌虫产卵(Liuetal., 2020)。PxylOBP33与上述多种寄主植物挥发物的结合潜力暗示其在小菜蛾寄主定位中发挥着作用。

OBPs除能与寄主植物挥发物结合外,还能有效地结合性信息素。本研究发现PxylOBP33具有与小菜蛾性信息素及其类似物等9种物质结合的潜力,其中与小菜蛾主要性信息素成分之一的Z11-16∶Ac结合能力最强,推测PxylOBP33可能参与小菜蛾雄虫感知性信息的过程。前期研究表明,小菜蛾PxylOBP33在未交配雄虫触角表达量最高(Caietal., 2021),这也进一步解释和说明了PxylOBP33可能在小菜蛾寻找配偶的过程中发挥重要作用。已有报道,小菜蛾性信息素结合蛋白PxylPBP1-3对小菜蛾性信息素及其类似物有很强的结合能力(Sunetal., 2013),PxylOBP33与PxylPBP1-3分布于进化树的一个分枝中,但进化关系较远(Caietal., 2021),这可能与小菜蛾在长期进化中OBPs向不同方向进化有关。鳞翅目其它昆虫的OBPs,如梨小食心虫GrapholitamolestaGmolOBP7、桃蛀螟ConogethespunctiferalisCpunOBP4、茶尺蠖EctropisobliquaEoblOBP9和EoblOBP11既能与植物挥发物结合,又可以与性信息素结合(Chenetal., 2018; 郭洪刚等, 2021; 严玉婷等, 2021),说明在进化过程中一种OBP不只负责一种信息化学物质的识别,同一昆虫中各OBPs协同互作,通过与寄主植物挥发物和昆虫性信息素等物质特异性识别,共同调节昆虫定位寄主和寻找配偶等行为(Britoetal., 2016)。

分子对接可以直观地明确OBPs与配体之间的结合方式,从大量的配体物质中筛选出OBPs的配体;荧光竞争结合试验也是一种常见的研究OBPs功能的方法,可以精准地判断OBPs与化学物质的结合能力(郭冰等, 2019)。荧光竞争结合试验可以弥补分子对接因软件评测带来的误差,而分子对接可以弥补荧光竞争结合试验中蛋白表达和纯化周期长的缺点,两种方法相辅相成。本研究中,通过分子对接发现PxylOBP33可与31种寄主植物挥发物和性信息素等物质结合,可能参与了小菜蛾定位寄主和寻找配偶等行为,为研究小菜蛾OBPs功能奠定了基础。今后将继续对筛选的物质进行荧光竞争结合试验,以进一步确定不同信息化学物质与PxylOBP33之间的结合能力,为新型绿色高效引诱剂的配制提供参考依据。