人MR1/IgG1 Fc二聚体融合蛋白的构建、表达及功能检测*

赵桂华, 龚业莉△, 翁秀芳

1江汉大学医学部免疫学教研室,武汉 430056 2华中科技大学同济医学院基础医学院免疫学系,武汉 430030

MHC Ⅰ类分子相关蛋白1(MR1)是一类非经典的MHC Ⅰ类分子,同CD1d一样位于1号染色体,与经典的Ⅰ类分子不同,人类MR1多样性较低,物种之间具有高度的同源性[1]。MR1和MHCⅠ一样,具有3个α结构域(α1～α3)、1个跨膜结构域和胞质尾区[2]。MR1通过α1～α3与血清β2微球蛋白(β2m)结合形成完整构象,将微生物产生的核黄素代谢产物及其它小分子代谢物提呈给黏膜相关恒定T(MAIT)细胞,使MAIT细胞激活[3-5]。MAIT细胞是一种在进化上高度保守的T细胞群,其被定义为趋化因子受体6(CCR6)+CD161+或CD161+TCR Vα7.2+,因其主要分布于黏膜且TCR由恒定的α链和非恒定的β链组成而命名,MAIT细胞在肝脏疾病和胃肠道黏膜病变中发挥着重要的作用[6-7]。现有研究发现能被MR1提呈且被MAIT细胞识别的抗原物质主要为5-(2-oxopropylideneamino)-6-D-ribitylaminouracil(5-OP-RU)、5-(2-oxoethylideneamino)-6-D-ribitylaminouracil(5-OE-RU)、5-amino-6-D-ribitylaminouracil(5-A-RU)、6-formylpterin(6-FP)以及一些小分子药物等[5,8]。目前MAIT细胞的研究工具主要是MR1四聚体,虽然可以对MAIT细胞进行检测与扩增,但因其为原核表达蛋白经折叠复性组装而成,存在翻译后修饰障碍,且该四聚体较难获得[8-9]。基于此,本研究建立MR1/IgG1 Fc二聚体昆虫表达体系,并利用该二聚体制备MR1/IgG1 Fc二聚体加载的人工抗原提呈细胞(artificial antigen presenting cells,aAPCs),即MR1 aAPCs,明确该MR1 aAPCs具有有效提呈大肠埃希菌来源代谢物并激活MAIT细胞的功能。该体系的建立为后续研究MAIT细胞反应性代谢物及MAIT细胞功能提供了新的工具。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 质粒、菌株和细胞系 pFastBacTMDual质粒、Sf9细胞均由华中科技大学同济医学院免疫系保存,感受态大肠埃希菌DH5α、DH10BacTM购自武汉易白生物技术有限公司。

1.1.2 试剂 引物均由擎科公司合成;XhoⅠ、KpnⅠ、SalⅠ、Hind Ⅲ限制性内切酶及硫酸盐乳胶微珠(Beads)均购自赛默飞公司;X-gal、IPTG购自白鲨(Biosharp)公司;T4连接酶和转染试剂(HighGene plus Transfection reagent)购自ABclonal公司;Sf9细胞培养液(SIM SF)购自义翘神州公司;纯化的鼠抗人CD28(Clone:28.2)购自Biolegend公司。流式抗体:APC-CY7标记抗人CD3(Clone:UCHT1),PE-CY7标记抗人Vα7.2(Clone:3C10),APC标记抗人CD161(Clone:HP-3G10),PE标记抗人CD69(Clone:FN50),PE标记抗人MR1(Clone:26.5)均购自BioLegend公司。兔抗人IgG Fc(货号:SPA205),APC标记羊抗兔IgG(货号:K0034G-APC),羊抗人IgG Fc(货号:SPA105),HRP标记的羊抗人IgG Fc(货号:SE105)均购自索莱宝(Solarbio)公司;CFSE(羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯)购自Sigma公司。

1.2 pFastBacTM Dual+[β2m+MR1/IgG1 Fc]质粒的构建

分离健康人的外周血单个核细胞,利用表1中的β2m-F1和β2m-R1引物通过RT-PCR获得β2m基因片段;通过Pubmed获取人MR1胞外段序列(α1、α2和α3)和人IgG1 Fc序列,送武汉擎科公司进行MR1胞外段和IgG1 Fc融合基因的全序列基因合成,构建pcDNA3.1(+)-[MR1/IgG1 Fc]质粒,利用表1的MR1-Fc-F2和MR1-Fc-R2引物扩增获得MR1/IgG1 Fc基因片段。将MR1/IgG1 Fc插入pFastBacTMDual的Pph启动子下游,将β2m插入pFastBacTMDual的Pp10启动子下游。转化DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆,用质粒小量抽提试剂盒抽提质粒。经过PCR鉴定后再经过双向测序鉴定(由武汉擎科公司完成),最终形成一个Pph方向含MR1/IgG1 Fc,Pp10方向含β2m的pFastBacTMDual+[β2m+MR1/IgG1 Fc]质粒,结构如图1A所示;将鉴定正确的pFastBacTMDual+[β2m+MR1/IgG1 Fc]转化DH10BacTM感受态细胞,挑取阳性克隆,按照Bac-to-Bac杆状病毒表达系统说明书提取含β2m+MR1/IgG1 Fc的穿梭质粒Bacmid(138 kb),经PCR鉴定后测序。

1.3 MR1/IgG1 Fc融合蛋白的表达和检测

用SIM SF(不含血清及蛋白)培养液于27℃无CO2的培养箱中培养Sf9细胞,2～3 d换1次液,待细胞生长至对数生长期,用重组杆粒Bacmid+[β2m+MR1/IgG1 Fc]和HighGene plus转染试剂混合进行转染,具体操作按说明书进行。待Sf9细胞全部由梭形变为圆形且细胞直径变大,胞内颗粒增多,收获培养上清,此上清中含有携带β2m+MR1/IgG1 Fc基因的病毒,再用此上清感染处于对数生长期的Sf9细胞,待扩增到P3时,大量感染Sf9细胞,5～6 d收集上清,即得到大量含有MR1/IgG1 Fc融合蛋白的上清。MR1/IgG1 Fc融合蛋白可通过Fc段经链间二硫键连接形成MR1/IgG1 Fc二聚体,具体结构见图1B。利用ELISA和Western blot对MR1/IgG1 Fc二聚体进行检测。将兔抗人IgG Fc抗体包被于硫酸盐乳胶微珠(dynalbeads)上,用APC标记羊抗兔IgG检测包被率。将浓缩后的MR1/IgG1 Fc二聚体与包被了兔抗人IgG Fc抗体的dynalbeads 4℃孵育24 h,用PE标记抗人MR1抗体检测MR1/ IgG1 Fc二聚体的构象。

1.4 基于MR1/IgG1 Fc二聚体人工抗原提呈细胞的建立及加载大肠埃希菌来源代谢物质

将纯化后的鼠抗人CD28抗体和兔抗人IgG1 Fc抗体包被在dynalbeads上,BSA封闭后与浓缩后富含MR1/IgG1 Fc二聚体的细胞培养上清4℃孵育24 h,制备获得加载MR1/IgG1 Fc二聚体的MR1 aAPCs,结构如图1C所示。培养扩增DH5α,离心收集培养上清以及DH5α细菌沉淀。取培养上清、细菌沉淀裂解后的水溶性物质、细菌沉淀裂解后的脂溶性物质,分别与上述制备好的MR1 aAPCs于4℃孵育24 h,制备成加载不同代谢物的MR1 aAPCs,即DH5α培养上清代谢物/MR1 aAPCs、DH5α水溶性代谢物/MR1 aAPCs、DH5α脂溶性物质/MR1 aAPCs。

1.5 MAIT细胞活化检测

分离健康个体的外周血单个核细胞(PBMCs),调整浓度至5×106/mL,与加载了不同DH5α代谢物质的MR1 aAPCs按2∶1比例共培养,每组细胞按200 μL体积培养,培养体系中均加入IL-2(终浓度为20 IU/mL),培养1 d后收细胞,按照说明书加入相应量的抗体(APC-CY7标记抗人CD3、PE-CY7标记抗人Vα7.2、APC标记抗人CD161、PE标记抗人CD69),室温孵育30 min,PBS洗涤2次,1500 r/min离心10 min,200 μL PBS重悬细胞,用流式细胞仪(FACSVerse,BD Bioscience,美国)对各组细胞进行检测,结果分析采用FlowJo软件。

1.6 MAIT细胞增殖检测

分离健康个体的PBMCs,将分离的PBMCs用不含血清和双抗的RPMI 1640培养液重悬至1×107/mL,加入CFSE染料(使终浓度为5 μmol/ mL),混匀,37 ℃细胞培养箱孵育20 min后加入冰胎牛血清5 mL,混匀后放37 ℃细胞培养箱孵育5 min,孵育结束后补满PBS,1500 r/min离心10 min,洗涤2遍,去除未结合的染料。CFSE标记好的PBMC用RPMI1640培养液重悬,调整PBMC浓度为5×106/mL,与加载了不同DH5α代谢物质的MR1 aAPCs按2∶1比例共培养,每组细胞按200 μL体积培养,培养体系中均加入IL-2(终浓度为20 IU/mL),培养7 d后收细胞,用相应的抗体进行染色,采用流式细胞术对各组细胞进行检测(方法同1.5)。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 pFastBacTM Dual+[β2m+MR1/IgG1 Fc]重组质粒的构建及鉴定

为了验证构建获得的pFastBacTMDual+[β2m+MR1/IgG1 Fc]表达质粒的正确性,我们通过特异性引物扩增pFastBacTMDual+[β2m+MR1/IgG1 Fc]质粒中β2m与MR1/IgG1 Fc融合基因,并通过DNA电泳检测其分子量大小。结果发现其中β2m编码基因为360 bp,MR1/IgG1 Fc融合基因为1902 bp,片段大小与预期一致(图2)。将pFastBacTMDual+[β2m+MR1/IgG1 Fc]质粒转化至DH10BacTM中,提取重组杆粒(Bacmid)后用M13通用型引物进行PCR扩增鉴定,未插入目的片段的Bacmid扩增产物大小为2560 bp,而插入目的片段后大小为4822 bp,电泳条带在5000 bp左右(图2),表明目的片段已成功插入杆粒中,含β2m+MR1/IgG1 Fc的穿梭质粒Bacmid构建成功。经过PCR鉴定正确的质粒送武汉擎科公司进行双向测序鉴定,测序结果与GenBank比对完全一致,进一步证实了碱基序列也完全无误(测序结果未显示)。

2.2 MR1/IgG1 Fc二聚体的检测及鉴定

用羊抗人IgG Fc和HRP标记羊抗人IgG Fc抗体进行双抗体夹心ELISA检测感染Sf9细胞的不同代感染培养上清中MR1/IgG1 Fc二聚体的含量。结果显示,在感染Sf9细胞第2代上清(P2)中开始检测到目的蛋白,在第3代(P3)的培养上清中MR1/IgG1 Fc二聚体的含量达到最高[(5.4±0.2)μg/mL](图3A)。取P3代的MR1/IgG1 Fc二聚体经β-巯基乙醇还原以后进行SDS变性聚丙烯凝胶电泳,用HRP标记羊抗人IgG Fc抗体可检测到在75 kD至100 kD之间的蛋白条带,与预期大小(90 kD)相符,结果如图3B、3C所示。

为了进一步明确MR1/IgG1 Fc二聚体构象的正确性以及用于制备MR1 aAPCs的可行性,我们通过兔抗人IgG Fc抗体包被,并特异性结合MR1/IgG1 Fc二聚体,从而加载MR1/IgG1 Fc二聚体到dynalbeads上,并通过抗完整构象MR1分子的抗体进行检测。首先,应用APC标记羊抗兔IgG抗体检测兔抗人IgG Fc抗体包被率,结果显示:兔抗人IgG Fc抗体能有效地包被在dynalbeads上,包被率为(94.25±3.38)%。将已包被兔抗人IgG Fc抗体的dynalbeads与MR1/IgG1 Fc二聚体上清孵育24 h后进行流式细胞术检测,结果显示MR1阳性率达(80.68±2.11)%,结果如图4所示。由于PE标记抗人MR1抗体是一种可以识别完整构象MR1的单克隆抗体,流式细胞术检测结果证实了MR1/IgG1 Fc二聚体具有正确的天然构象,并且通过兔抗人IgG Fc抗体包被,特异性结合MR1/IgG1 Fc二聚体,可有效加载完整构象的MR1/IgG1 Fc二聚体到dynalbeads上,并基于此方式制备MR1 aAPCs。

2.3 加载DH5α源性代谢物的MR1 aAPCs对MAIT细胞活化与增殖的影响

取DH5α培养上清、细菌沉淀裂解后的水溶性重悬液、细菌沉淀裂解后的脂溶性重悬液,加载制备好的MR1 aAPCs制备成DH5α培养上清/MR1 aAPCs、DH5α水溶性代谢物/MR1 aAPCs、DH5α脂溶性物质/MR1 aAPCs,并刺激健康人PBMCs。结果显示:与PBMCs对照组相比,DH5α培养上清/MR1 aAPCs与DH5α水溶性代谢物/MR1 aAPCs均能显著提高MAIT细胞中CD69+细胞比例,差异具有统计学意义[CD69+MAIT细胞频率:(34.97±3.67)%vs.(6.97±1.38)%,P<0.05;(43.8±6.81)%vs.(6.97±1.38)%,P<0.05],DH5α脂溶性物质/MR1 aAPCs共培养组中MAIT细胞CD69+细胞比例增加,但差异无统计学意义[CD69+MAIT细胞频率:(15.41±10.75)%vs.(6.97±1.38)%,P>0.05](图5)。这些结果提示DH5α培养上清及水溶性裂解代谢物中含有能够刺激MAIT细胞活化的物质。

应用DH5α培养上清/MR1 aAPCs、DH5α水溶性代谢物/MR1 aAPCs、DH5α脂溶性物质/MR1 aAPCs,进行PBMCs 7 d刺激与增殖检测,结果显示:与PBMCs对照组相比,DH5α培养上清/MR1 aAPCs与DH5α水溶性物质/MR1 aAPCs均能诱导MAIT细胞增殖水平增加,差异具有统计学意义[增殖MAIT细胞比例:(33.2±0.9)%vs.(12.8±4.03)%,P<0.05;(36.95±2.35)%vs.(12.8±4.03)%,P<0.05],DH5α脂溶性物质/MR1 aAPCs也能诱导MAIT细胞增殖水平增加,但差异无统计学意义[增殖MAIT细胞比例:(18.33±9.37)%vs.(12.8±4.03)%,P>0.05](图6)。以上结果说明,基于MR1的抗原提呈细胞(MR1 APCs)具有提呈大肠埃希菌来源代谢物质的功能,并且能够诱导MAIT细胞活化和增殖水平增加。

这些结果综合说明基于MR1/IgG1 Fc二聚体的aAPCs能够有效刺激MAIT细胞,并筛选鉴定含有MAIT细胞反应性的复杂细菌代谢混合物;DH5α培养上清及水溶性裂解代谢物中含有促进MAIT细胞活化与增殖的代谢物。

3 讨论

MR1是一种多样性较低的MHC Ⅰ分子类似物[10],在大多数哺乳动物中高度保守。在人类中,它存在于染色体1q25.3上,与CD1基因非常接近[11]。MR1提呈的抗原可被MAIT细胞识别而激活MAIT细胞[12-13]。MAIT细胞的激活可通过TCR依赖性和非TCR依赖性途径,TCR途径主要是通过识别MR1提呈的细菌核黄素代谢途径产物[14-16],非TCR途径主要是细胞因子IL-12和IL-18的刺激[17]。已有的研究表明,MAIT细胞可以被MR1提呈的细菌核黄素途径维生素B类代谢物激活,如5-OP-RU和5-OE-RU,但不能被6-FP和acetyl-6-formylpterin(Ac-6-FP)等激活,这是因为这些物质与MAIT细胞的TCR没有相互作用[18-19]。然而,MAIT细胞的激活和抑制配体仍不明确,5-OP-RU是迄今为止最有效的MAIT细胞激活剂,因为它能够上调MR1并与MAIT细胞的TCR相互作用[20]。MAIT细胞目前的研究工具主要是将典型配体5-OP-RU与MR1四聚体结合形成的5-OP-RU/MR1四聚体,用于鉴定MAIT细胞。此外,将装载抗原的MR1四聚体和人CD28抗体加载至乳胶珠上制成人工抗原提呈细胞可用于扩增MAIT细胞[21-22]。虽然装载5-OP-RU的MR1四聚体可以最大程度地检测和扩增MAIT细胞,但由于MR1四聚体中MR1分子为原核表达,5-OP-RU与MR1四聚体的结合较难被其他物质替换,所以该工具在研究新的MAIT细胞激活物中存在局限。为了拓展MAIT细胞激活物的研究,本研究将MR1胞外段抗原识别区域与IgG1 Fc段基因通过基因拼接技术和Bac-to-Bac表达系统表达具有MR1二聚体结构的蛋白,在MR1二聚体的抗原识别区域加载抗原物质即可探究影响MAIT细胞活化的物质。我们选择大肠埃希菌来源的代谢物作为研究对象。研究结果显示,大肠埃希菌(DH5α)培养上清及水溶性裂解物能够被MR1 aAPCs所提呈并成功激活MAIT细胞,说明水溶性代谢物能更好地使MAIT细胞活化和增殖。已有研究表明5-OP-RU通过分子间极性接触网在MR1 A′结构槽中定位,其中包括其5-OH以及2-OH基团与MAIT细胞TCR之间的氢键作用,而分子的极性特征也决定其水溶性,因此我们推测代谢物的分子基团结构与其能使MAIT细胞活化和增殖的程度相关[18],后续将对结合在MR1 aAPCs上的代谢物进行进一步研究,探究其结构特征。上述结果表明,我们前期构建的MR1二聚体具有生物学功能,且基于MR1二聚体的人工抗原提呈细胞将为研究MAIT细胞反应性代谢物及MAIT细胞功能提供新的工具。