黄芪颗粒联合微RNA-30a对肾病综合征小鼠肾组织中内质网应激相关蛋白、有丝分裂原活化蛋白激酶蛋白和血清炎症因子水平的影响

徐 瑞，张 晓，刘文霞

(南阳市第一人民医院儿三科,河南 南阳 473000)

原发性肾病综合征(primary nephrotic syndrome,PNS)是常见的慢性肾脏病之一,好发于儿童。据我国统计数据显示,在所有住院泌尿系统疾病患者中,PNS患者占25%[1-2]。有研究发现,85%以上的PNS儿童以微小病变为主要病理改变,因此,用糖皮质激素治疗PNS具有一定疗效,但约有50%的患儿在经过激素治疗后,会由PNS发展为频繁复发性肾病综合征(frequently relapsing nephrotic syndrome,FRNS)[3-4]。目前,肾病综合征易导致患儿出现多种并发症,包括感染、血栓栓塞、急性肾损伤等,对患儿的身心健康造成严重的威胁。研究发现,脂质代谢异常、炎症反应、免疫功能紊乱等是引起肾病综合征发病的主要原因[5],但其具体发病机制尚不明确。目前,临床上多使用糖皮质激素及免疫抑制剂治疗肾病综合征,但其毒副作用较大,部分患者极易产生激素依赖和抵抗,导致治疗效果较差[6]。因此,寻找新的、高效的治疗药物是目前临床治疗肾病综合征亟需解决的难题。黄芪是一种益气补血中药,黄芪颗粒是以黄芪为主药,经现代技术制备而成的中药制剂[7]。研究发现,黄芪因具有增强机体免疫功能、保肝、抗衰老、降压等多种生理学功效,被广泛应用于临床[8];但目前关于黄芪在肾病综合征中的作用机制报道较少。近年来微RNA(microRNA,miRNA)在肾脏疾病中的作用被学者们发现,并进行了广泛的研究。有研究发现,miRNA可维持足细胞分化、足突功能和肾小球滤过屏障的完整性,还可破坏基因网络,进而导致进行性蛋白尿肾小球硬化发生[9]。有研究证实,正常小鼠肾脏足细胞和集合管上皮细胞中均存在miR-30a-5p的表达,抑制小鼠肾脏中miR-30a-5p的表达,异常的肾小球得到明显改善[10]。但目前关于miR-30a治疗肾病综合征的机制鲜有报道。近年来,我国中西医结合治疗肾病综合征得到学者们的广泛关注,其不仅可改善患者临床症状,还能预防术后并发症的发生[11]。因此,本研究采用黄芪颗粒联合miR-30a来治疗PNS小鼠,并观察其对小鼠肾组织中内质网应激相关蛋白、有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)蛋白和血清炎症因子水平的影响,探讨黄芪颗粒联合miR-30a治疗PNS的效果及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

无特定病原级8周龄雄性小鼠50只,体质量18～20 g,购自深圳市益诺思生物医药安全评价研究院有限公司,许可证号为SYXK(粤)2021-0271。小鼠统一饲养于室温20～24 ℃、相对湿度60%的动物房内,12 h明暗光源交替。适应性喂养7 d后进行后续实验。

1.2 试剂与仪器

黄芪颗粒购自四川百利药业有限责任公司(国药准字Z20003380),miR-30a拮抗剂(miR-30a antagomir)购自苏州吉玛基因股份有限公司,兔抗p38 MAPK、p-p38 MAPK、磷酸化线粒体外活化蛋白激酶(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase,p-ERK)、线粒体外活化蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)抗体购自美国Cell Signaling Technology公司,白细胞介素(interleukin,IL)-8、IL-6和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司,苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司,双硫仑/硫氰酸胍蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组及模型制备

将50只小鼠随机分为对照组(n=10)和模型组(n=40)。模型组小鼠经尾静脉注射阿霉素溶液(7.5 mg·kg-1)制备PNS模型,对照组小鼠经尾静脉注射等体积生理盐水。观察模型组小鼠给药后6周的生长情况,并通过动态监测24 h尿蛋白及其他生物化学指标来判定模型是否制备成功。共3只小鼠造模失败,予以补充后将40只小鼠随机分为PNS组、 黄芪组、miR-30a组和黄芪+miR-30a组,每组10只。黄芪组小鼠灌胃黄芪颗粒冲剂(20 mg·g-1),每日2次;miR-30a组小鼠经尾静脉注射miR-30a antagomir(10 mg·kg-1),每周1次;黄芪+miR-30a组小鼠灌胃黄芪颗粒冲剂(20 mg·g-1),同时经尾静脉注射miR-30a antagomir(10 mg·kg-1);模型组和对照组小鼠灌胃与黄芪组等量的生理盐水,每日1次;各组小鼠干预4周后进行后续实验。

1.3.2 各组小鼠24 h尿蛋白检测

于给药0、2、4周时,将各组小鼠置于代谢笼中,均禁食不禁水,分别收集并记录各组小鼠24 h尿液,使用生物化学自动检测仪检测小鼠24 h 尿蛋白。

1.3.3 各组小鼠血清中生物化学指标和炎症因子水平检测

各组小鼠于末次给药24 h后,腹腔注射体积分数10%水合氯醛麻醉小鼠,抽取各组小鼠腹主动脉血10 mL,离心后收集上层血清。使用全自动生物化学分析仪检测小鼠血清中总胆固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(trigalloyl glycerol,TG)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和血肌酐(serum creatinine,Scr)水平;采用ELISA法检测血清中炎症因子IL-6、IL-8和TNF-α水平。

1.3.4 HE染色观察各组小鼠肾组织病理学变化

取血后处死各组小鼠,取部分肾脏组织置于-80 ℃冰箱保存;剩余肾组织置于多聚甲醛溶液中固定 24 h,然后置于石蜡中,包埋组织后切片(厚度为4 μm),将苏木精染色液加入到组织切片中,3 min后取出并用伊红染色,中性树脂封片,显微镜观察肾组织病理学变化。

1.3.5 免疫组织化学法检测各组小鼠肾组织中内质网应激相关分子糖调节蛋白-78(glucose-regulated protein-78,GRP-78)和激活转录因子6(activating transcription factor 6,ATF6)蛋白表达

取小鼠肾组织石蜡切片,切片移入体积分数0.1% Tritonx-100,室温孵育30 min,山羊血清封闭30 min,加入11 000 稀释的兔抗鼠GRP-78和ATF6一抗,37 ℃ 孵育1 h,4 ℃过夜,磷酸盐缓冲液洗3次,加二抗室温孵育1 h,亲和-生物素复合物液孵育1 h,3,3-二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)染色,裱片、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、树胶封片。每组选取肾组织切片40张,应用Image J软件分析肾组织中GRP-78和ATF6蛋白的表达。

1.3.6 Western blot法检测各组小鼠肾组织中GRP-78、ATF6、p38 MAPK、p-p38 MAPK、p-ERK、ERK蛋白表达

取冻存的肾组织,于匀浆器中尽量剪碎,加入裂解液于冰上裂解,采用二喹啉甲酸法测定蛋白浓度。 使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白,湿转法转至聚偏二氟乙烯膜上,加入脱脂牛奶封闭1 h;加入GRP-78(11 000)、ATF6(11 000)、p38 MAPK(11 000)、p-p38 MAPK(11 000)一抗,4 ℃ 孵育过夜。 加入免疫印迹荧光标记山羊抗兔IgG二抗(13 000),37 ℃ 孵育40 min。滴加增强型电化学发光显色液,暗室中曝光、显影,应用化学发光成像系统进行图像采集,应用Image J软件分析各条带灰度值,以β-actin为内参,以目的蛋白灰度值与内参蛋白灰度值比值表示目的蛋白相对表达量。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 5组小鼠24 h尿蛋白比较

给药0周时,PNS组、黄芪组、miR-30a组和黄芪+miR-30a组小鼠24 h尿蛋白比较差异无统计学意义(P>0.05)。PNS组、黄芪组、miR-30a组和黄芪+miR-30a组小鼠给药0、2、4周时的24 h尿蛋白显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。给药2、4周时,黄芪组、miR-30a组和黄芪+miR-30a组小鼠24 h尿蛋白显著低于PNS组,差异有统计学意义(P<0.05);黄芪组与miR-30a组小鼠的24 h尿蛋白比较差异无统计学意义(P>0.05);黄芪+miR-30a组小鼠24 h尿蛋白显著低于黄芪组和miR-30a组,差异有统计学意义(P<0.05)。结果见表1。

表1 5组小鼠24 h尿蛋白比较Tab.1 Comparison of 24-hour urinary protein of mice among the five groups

2.2 5组小鼠血清中TC、TG、BUN、Scr水平比较

PNS组、黄芪组、miR-30a组和黄芪+miR-30a组小鼠血清中TC、TG、BUN、Scr水平显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);黄芪组、miR-30a组和黄芪+miR-30a组小鼠血清中TC、TG、BUN、Scr水平显著低于PNS组,差异有统计学意义(P<0.05);黄芪组与miR-30a组小鼠血清中TC、TG、BUN、Scr水平比较差异无统计学意义(P>0.05);黄芪+miR-30a组小鼠血清中TC、TG、BUN、Scr水平显著低于黄芪组和miR-30a组,差异有统计学意义(P<0.05)。结果见表2。

表2 5组小鼠血清中TC、TG、BUN、Scr水平比较Tab.2 Comparison of serum TC,TG,BUN and Scr levels of mice among the five groups

2.3 5组小鼠血清中炎症因子水平比较

PNS组、黄芪组、miR-30a组和黄芪+miR-30a组小鼠血清中IL-6、IL-8、TNF-α水平显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);黄芪组、miR-30a组和黄芪+miR-30a组小鼠血清中IL-6、IL-8、TNF-α水平显著低于PNS组,差异有统计学意义(P<0.05);黄芪组与miR-30a组小鼠血清中IL-6、IL-8、TNF-α水平比较差异无统计学意义(P>0.05);黄芪+miR-30a组小鼠血清中IL-6、IL-8、TNF-α水平显著低于黄芪组和miR-30a组,差异有统计学意义(P<0.05)。结果见表3。

表3 5组小鼠血清中炎症因子水平比较Tab.3 Comparison of inflammatory factor levels in serum of mice among the five groups

2.4 各组小鼠肾组织病理学变化比较

对照组小鼠肾小球排列规则,无明显炎症细胞浸润;PNS组小鼠肾小球排列不规则,有大量的炎症细胞浸润到肾间质;与PNS组相比,黄芪组和miR-30a组小鼠肾组织病理学变化得到明显改善,肾间质炎症细胞浸润明显减少;黄芪+miR-30a组小鼠肾间质偶见炎症细胞,肾组织改善情况明显好于黄芪组和miR-30a组;见图1。

图1 5组小鼠肾组织病理学形态(HE染色,×200)Fig.1 Histopathological morphology of renal tissue of mice in the five groups(HE staining,×200)

2.5 5组小鼠肾组织中GRP-78和ATF6蛋白表达比较

PNS组、黄芪组、miR-30a组和黄芪+miR-30a组小鼠肾组织中GRP-78和ATF6蛋白表达显著多于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);黄芪组、miR-30a组和黄芪+miR-30a组小鼠肾组织中GRP-78和ATF6蛋白表达显著低于PNS组,差异有统计学意义(P<0.05);黄芪组与miR-30a组小鼠肾组织中GRP-78和ATF6蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05);黄芪+miR-30a组小鼠肾组织中GRP-78和ATF6蛋白表达显著低于黄芪组和miR-30a组,差异有统计学意义(P<0.05)。结果见图2和表4。

图2 5组小鼠肾组织中GRP-78和ATF6蛋白表达(免疫组织化学染色,×200)Fig.2 Expressions of GRP-78 and ATF6 protein in renal tissue of mice in the five groups(immunohistochemical staining,×200)

表4 5组小鼠肾组织中GRP-78和ATF6蛋白相对表达量比较Tab.4 Comparison of relative expression levels of GRP-78 and ATF6 protein in renal tissue of mice among the five groups

2.6 5组小鼠肾组织中GRP-78、ATF6、p38 MAPK、p-p38 MAPK、p-ERK、ERK蛋白表达比较

PNS组、黄芪组、miR-30a组和黄芪+miR-30a组小鼠肾组织中GRP-78、ATF6蛋白相对表达量及p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK/ERK比值显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);黄芪组、miR-30a组和黄芪+miR-30a组小鼠肾组织中GRP-78、ATF6蛋白相对表达量及p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK/ERK比值显著低于PNS组,差异有统计学意义(P<0.05);黄芪组与miR-30a组小鼠肾组织中GRP-78、ATF6蛋白相对表达量及p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK/ERK比值比较差异无统计学意义(P>0.05);黄芪+miR-30a组小鼠肾组织中GRP-78、ATF6蛋白相对表达量及p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK/ERK比值显著低于黄芪组和miR-30a组,差异有统计学意义(P<0.05)。结果见图3和表5。

图3 5组小鼠肾组织中GRP-78、ATF6、p38 MAPK、p-p38 MAPK、p-ERK、ERK蛋白表达(Western blot)Fig.3 Expressions of GRP-78,ATF6,p38 MAPK,p-p38 MAPK,p-ERK and ERK protein in renal tissue of mice in the five groups(Western blot)

表5 5组小鼠肾组织中GRP-78、ATF6蛋白相对表达量及p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK/ERK比值比较Tab.5 Comparison of the expressions of GRP-78,ATF6 protein and the ratios of p-p38 MAPK/p38 MAPK,p-ERK/ERK in renal tissue of mice among the five groups

3 讨论

肾病综合征是具有明显特征的临床症候群,包括尿蛋白高于3.5 g·L-1、血浆白蛋白低于30 g·L-1、高脂血症及代谢紊乱等,通常由肾小球毛细血管滤过膜受到损伤所致。肾病综合征在临床上为常见病,4～12岁儿童的发病率尤为高,严重危害人类的生命健康。目前,临床上主要采用糖皮质激素来治疗肾病综合征,多通过检测尿蛋白水平来判断治疗效果。本研究结果显示,肾病综合征模型小鼠24 h尿蛋白及血清中TC、TG、BUN、Scr水平均明显增加,且肾小球体积增大,肾小管中有空泡性病变且伴有炎症细胞浸润,与桑素珍等[12]报道的结果一致,提示肾病综合征小鼠模型制备成功,小鼠体内出现血脂异常、炎症反应和肾脏纤维化。有研究发现,在环境、遗传等多种因素作用下,肾病的患病率明显增加[13]。目前,中西医结合治疗肾病综合征被学者们广泛关注,其中黄芪是最具有代表性的药物之一。黄芪是一种滋补性中药,其味甘性温,具有补气升阳、扶正固本的功效。黄芪的多种成分如皂苷、多糖、氨基酸等可介导机体的特异性和非特异性免疫反应[14]。有学者采用黄芪来治疗小儿呼吸道感染、肾移植术后肺部感染等,结果发现,患儿的治疗效果较好[15]。本研究结果显示,黄芪颗粒显著降低PNS小鼠24 h尿蛋白和血清中TC、TG、BUN、Scr水平,提示黄芪颗粒可有效改善肾病综合征小鼠体内血脂异常和炎症反应,抑制纤维化。崔冰等[16]研究发现,肾病综合征患者给予黄芪辅助治疗后,血清清蛋白水平明显升高,免疫功能得到明显改善,且未观察到不良反应发生。

肾脏纤维化是肾病综合征重要的病理过程,肾纤维化是由慢性炎症所致,炎症因子和细胞因子通过上皮向间质转化刺激细胞外基质成分的过度积累,进而导致肾纤维化。IL-6是体内重要的细胞炎症因子之一,参与肾小球疾病的免疫损伤过程,与肾脏疾病的发生发展密切相关。研究发现,机体中多种免疫细胞均可分泌IL-6,包括淋巴细胞、巨噬细胞、成纤维细胞等;当IL-8、TNF-α和氧化应激等多种因素刺激免疫细胞时会增加IL-6的分泌[17]。有研究发现,正常肾组织中存在一定量的IL-6、IL-8、TNF-α,对肾组织的结构和功能有很好的维持作用;但在病理情况下,肾组织中IL-6、IL-8、TNF-α水平会因多种因素的刺激而增加,导致肾小球组织结构和功能发生异常[18]。本研究结果显示,与对照组比较,PNS组小鼠血清中IL-6、IL-8、TNF-α水平显著升高,提示肾病综合征可引起机体的炎症反应;采用黄芪颗粒干预后血清中IL-6、IL-8、TNF-α水平均显著降低,说明黄芪颗粒可通过抑制炎症因子的分泌减轻肾病综合征小鼠机体内的炎症反应。高宏宇等[19]研究报道,降低肾病综合征小鼠血清中炎症因子水平可减轻肾脏损伤,抑制肾脏纤维化。有研究证实,p38 MAPK信号通路可介导炎性细胞的多种生物学过程,包括增殖、凋亡等;p-p38 MAPK可对环磷酸腺苷进行调节,进而激活炎症信号通路,导致细胞外基质积聚,从而导致肾小球硬化的发生和发展[20]。本研究结果显示,黄芪颗粒可显著降低小鼠肾组织中p38 MAPK蛋白表达,提示黄芪颗粒可通过抑制炎性细胞生物学过程而减轻肾病综合征损伤。曾文英等[21]研究证实,抑制小鼠肾脏组织中p38 MAPK-纤维连接蛋白信号通路可减轻肾脏损伤。

内质网应激广泛参与肾病的发生和发展。内质网是由真核细胞进行合成、折叠和成熟的细胞器,ATF6是内质网膜上一种主要跨膜蛋白,正常情况下,ATF6能以无活性的状态结合GRP78,通过发生应激反应而激活具有病毒复制作用的相关蛋白。具有病毒复制作用的相关蛋白可通过对内质网过负荷的抑制,进而对细胞进行保护,当内质网存在持续应激或应激增强时,内质网应激相关的凋亡通路会被启动,进而对细胞的凋亡进行诱导。本研究结果显示,黄芪颗粒可降低肾病综合征小鼠内质网应激相关蛋白ATF6和GRP-78的表达,提示黄芪颗粒对肾病综合征小鼠内质网应激有明显的抑制作用。

miRNA是一类长度高度保守的单链非编码小分子RNA,广泛参与细胞增殖、凋亡、分化、免疫、代谢等生理过程,与肿瘤、糖尿病、心血管疾病的发生密切相关[22]。miR-30a家族可调节肾脏的生长发育,尤其是肾小管上皮细胞的分化和增殖。本研究结果显示,抑制miR-30a可降低肾病综合征小鼠24 h尿蛋白和血清中TC、TG、BUN、Scr水平,抑制小鼠血清中炎症因子IL-6、IL-8、TNF-α水平、肾组织中内质网应激相关蛋白ATF6、GRP-78表达及肾组织中p38 MAPK蛋白的表达。提示miR-30a可降低肾病综合征小鼠24 h尿蛋白,降低炎症水平和内质网应激,减少肾组织中p38 MAPK蛋白表达。张莹等[23]研究发现,肾病综合征患儿血清中miR-30a呈高表达,与血清白蛋白、尿蛋白定量和肾小管损伤密切相关,对肾病综合征具有一定的诊断价值。本研究还发现,黄芪颗粒联合miR-30a可降低肾病综合征小鼠24 h尿蛋白,抑制炎症水平和内质网应激,减少肾组织中p38 MAPK蛋白表达,且效果优于单独使用黄芪颗粒或miR-30a。

4 结论

黄芪颗粒联合miR-30a可明显降低肾病综合征小鼠内质网应激,减轻炎症水平,抑制肾组织中MAPK蛋白表达。