巴戟天对骨关节炎小鼠软骨细胞自噬、凋亡的影响及机制

赵东方，尉志强，邢姝琴，祁 姣，黄江海，温鑫柱，王亚非

(1.北京中医药大学东方医院骨科,北京 100078;2.北京中医药大学东方医院肿瘤科,北京 100078;3.北京中医药大学东方医院经开院区门诊护理部,北京 100176)

骨关节炎是一种以关节软骨损害为主的关节疾病,其特征为关节软骨退行性变和继发性骨质增生,随着疾病的发展,最终造成整个关节面的损害[1]。现代医学尚不能完全解释骨关节炎的发病机制,但研究表明其与环境刺激、免疫功能、内分泌、药物使用等多种因素有关[2-3]。目前,临床上对于骨关节炎的治疗主要以手术及药物治疗为主,其中手术治疗主要针对重度骨关节炎患者[4],对于轻中度骨关节炎患者的治疗,主要通过药物达到抗炎、消肿、镇痛、恢复关节功能的治疗效果[5]。研究表明,长期使用骨关节炎治疗药物容易导致患者机体多系统产生不良反应[6],因此,不良反应较低的中药治疗日益受到临床关注。巴戟天是茜草科巴戟天属植物巴戟天的干燥根,现代药理学研究表明,巴戟天具有抗抑郁、抗骨质疏松、抗炎、防治阿尔兹海默症、改善生殖、保护心脑血管等诸多功效[7],但目前国内对于其在骨关节炎治疗方面的研究尚属空白。有研究报道,临床骨关节炎患者外周血中炎症因子白细胞介素(interleukin,IL)-1β的表达异常。而近期一项关于骨关节炎的实验研究表明,IL-1β与软骨细胞凋亡水平密切相关[8]。另有研究表明,骨关节炎疾病发展程度越高,其软骨细胞自噬水平越低[9]。因此,与自噬及凋亡相关的磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信号通路在骨关节炎的发展及治疗过程中是否发挥作用值得深入研究。基于此,本研究建立骨关节炎小鼠模型,探讨巴戟天对骨关节炎小鼠软骨细胞凋亡、自噬的影响及可能机制,以期为巴戟天治疗骨关节炎的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

12周龄健康C57BL/6雄性小鼠40只,体质量(24±2)g,购自广东省医学实验动物中心(动物许可证号:44007200041000),标准饲养于室温25 ℃、相对湿度(40±2)%、每日12 h/12 h明暗交替的清洁级动物房中,适应性饲养1周。

1.2 主要试剂与仪器

含吐温的Tris缓冲生理盐水(Tris-buffered saline and tween-20,TBST)、达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium,DMEM)购自上海碧云天生物技术有限公司,巴戟天生药购自杭州鼎好科技有限公司,自噬效应蛋白1(Beclin1)、人微管相关蛋白轻链3B(human microtubule-associated protein light chain,LC3B)、磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphorylated phosphatidylinositol-3-kinase,p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated-protein kinase B,p-Akt)、抗体及二抗购自美国Abcam生物技术有限公司,内参β-肌动蛋白(β-actin)抗体购自北京博奥森生物技术有限公司,原位末端转移酶标记(TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)染色试剂盒、总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒和实时荧光定量聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)试剂盒、蛋白提取试剂盒购自北京利维宁生物科技有限公司,RT-PCR引物由上海赛默飞世尔(中国)有限公司合成,凋亡试剂盒及蛋白标记物购自南京良纬科技有限公司;Western blot 凝胶电泳仪购自北京六一仪器厂,JP-K300显影仪购自上海嘉鹏科技有限公司,RT-PCR仪和Transwell小室购自美国Thermo Fisher Scientific公司,流式细胞仪购自美国BD公司,高速离心机购自日本日立公司,细胞孵育箱购自上海川宏实验仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型制备及处理

将40只C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组和低、中、高剂量巴戟天组,每组8只。参照钟宇辰等[10]方法制备小鼠骨关节炎模型:模型组和低、中、高剂量巴戟天组小鼠给予戊巴比妥钠麻醉后剔除右侧膝关节处毛发,将 0.2 mg 碘乙酸溶于10 μL 磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)中注入膝关节腔;随后,模型组小鼠每日给予1 mL生理盐水灌胃,低、中、高剂量巴戟天组小鼠每日分别将100、200、400 mg·kg-1巴戟天溶于1 mL生理盐水灌胃,均持续4周;对照组小鼠制备骨关节炎假模型:给予戊巴比妥钠麻醉后剔除右侧膝关节处毛发,将10 μL PBS注入膝关节腔,随后每日给予1 mL生理盐水灌胃,持续4周。4周后处死所有小鼠,收集各组小鼠右侧膝关节组织,断离周围肌肉组织,无菌条件下从肱骨、股骨远端和胫骨近端关节面切取软骨,分为2部分,分别用于组织包埋和提取软骨细胞。

1.3.2 各组小鼠软骨细胞悬液的制备

将各组小鼠拟提取软骨细胞的软骨剪碎成1 mm×1 mm×1 mm的组织块,用D-Hanks液冲洗3次,将软骨组织块移入50 mL消化小瓶内,加入2.5 g·L-1胰蛋白酶 6 mL,于37 ℃恒温水浴振荡器内消化30 min,于消化小瓶内加入6 mL用DMEM配制的2型胶原酶(2 g·L-1),于37 ℃恒温水浴振荡器内消化3次,每次60 min,将每次消化所得软骨细胞悬液稍作吹打,收集于离心管中,经200目筛网过滤,1 000 r·min-1离心5 min后弃上清,用DMEM洗涤2次,最后加入5 mL软骨细胞培养基配成软骨细胞悬液。

1.3.3 TUNEL染色检测各组小鼠软骨组织中软骨细胞凋亡率

将各组小鼠右膝关节软骨组织固定包埋并切片;二甲苯Ⅰ脱蜡10 min,二甲苯Ⅱ脱蜡2次、每次10 min;脱蜡至蒸馏水浸泡漂洗,加入蛋白酶K工作液(蛋白酶K原液PBS=19),37 ℃温箱孵育22 min,PBS晃动洗涤3次,每次5 min;切片稍甩干后滴加破膜工作液(triron原液PBS=11 000),常温孵育20 min,PBS晃动洗涤3次,每次5 min;切片稍甩干后滴加Buffer,常温孵育10 min;切片稍甩干后滴加反应液(TDT酶dUTPBuffer=1550),湿盒内37 ℃温箱孵育2 h。洗涤3次后滴加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染液,避光室温孵育10 min,PBS晃动洗涤3次,每次5 min。切片稍甩干后圈内滴加抗荧光淬灭封片剂封片。每张切片于荧光显微镜下随机选取5个视野拍照观察,观察细胞凋亡情况:每例切片计数5个200倍视野,以每个视野中凋亡细胞数占细胞总数的百分率计算凋亡率。实验重复3次,取均值。

1.3.4 流式细胞术检测各组小鼠软骨细胞悬液中软骨细胞凋亡情况

取配置好的软骨细胞悬液5 mL,用冰上预冷10 min的体积分数70%乙醇固定2 h后弃上清液,调整细胞浓度为1×109L-1,加入流式管中,根据细胞凋亡试剂盒说明书,加入5 μL的Annxin V和5 μL溴化乙锭,震荡混匀,在37 ℃恒温孵育箱中避光恒温孵育,25～30 min后用200目细胞滤网过滤,避免细胞成团,然后转移至流式管中,应用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。实验重复3次,取均值。

1.3.5 Western blot法检测各组小鼠软骨细胞悬液中p-Akt、p-PI3K、Beclin1、LC3B蛋白表达

取软骨细胞悬液5 mL,加入400 μL蛋白裂解液,冰上裂解10 min,4 ℃、12 000 r·min-1离心10 min,取上清液,置于EP管中,加入十二烷基磺酸钠混匀,置于沸水中水煮5 min变性。将蛋白样本进行上样、电泳及转膜。转膜结束后用TBST清洗3次,随后加入含有p-Akt(11 000)、p-PI3K(11 000)、Beclin1(11 000)、LC3B(11 000)及β-actin(1500)一抗溶液的孵育盒中,4 ℃封闭过夜;TBST清洗3次后加入相对应二抗,37 ℃封闭1 h,洗膜,将化学发光显影液均匀涂在膜上反应2 min,用滤纸吸去多余的底物液,通过蛋白显影仪拍照,应用Image J软件分析目的蛋白的灰度值,以目的蛋白灰度值与内参蛋白灰度值的比值代表目的蛋白的相对表达量。

1.3.6 RT-PCR法检测各组小鼠软骨细胞悬液中p-PI3K、p-Akt mRNA的表达

取配置好的软骨细胞悬液5 mL置于EP管,向其中加入1 mL TRIzol试剂,冰上孵育5～10 min,加入预冷的氯仿0.2 mL,继续冰上孵育5 min后,1 200 r·min-1离心15 min,转移水相,加入等体积异丙醇后再次离心10 min,弃上清液,加预冷的体积分数75%乙醇洗涤,弃上清后风干,加入100 μL的无酶水溶解制得总RNA备用;根据反转录试剂盒说明书将制备好的总RNA反转录为cDNA,随后按照RT-PCR试剂盒说明书的操作步骤加入SYBR Green染料及p-PI3K、p-Akt及β-actin上、下游引物,混合离心,于PCR仪上进行扩增,反应程序: 94 ℃ 预 变 性 5 min;94 ℃变性25 s,62 ℃退火40 s,70 ℃延伸60 s,重复 30个循环,72 ℃延伸10 min。p-PI3K上游引物序列为5′-GACTTGTCATTCACTCTACCG-3′,下游引物序列为5′-TGAGTAGGACCACAGTGCCA-3′;p-Akt上游引物序列为5′-GAGGTGTTAGAACCACGCCA-3′,下游引物序列为5′-TCAATCAGCAGCAGGAAT-3′;β-actin上游引物序列为5′-TCACGGTATGTCAACTCGCAAT-3′,下游引物序列为5′-AAGAGTAACGAGAAGTAAGCA-3′。延伸完成后作溶解曲线,采用2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。实验重复 3次,取均值。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 5组小鼠软骨组织中软骨细胞凋亡率比较

对照组、模型组以及低、中、高剂量巴戟天组小鼠软骨组织中软骨细胞凋亡率分别为(2.46±0.17)%、(42.10±7.57)%、(28.47±3.69)%、(22.90±2.58)%、(8.63±1.24)%。模型组和低、中、高剂量巴戟天组小鼠软骨组织中软骨细胞凋亡率显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);低、中、高剂量巴戟天组小鼠软骨组织中软骨细胞凋亡率显著低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。中、高剂量巴戟天组小鼠软骨组织中软骨细胞凋亡率显著低于低剂量巴戟天组,差异有统计学意义(P<0.05)。高剂量巴戟天组软骨组织中软骨细胞凋亡率显著低于中剂量巴戟天组,差异有统计学意义(P<0.05)。结果见图1。

A:对照组;B:模型组;C:低剂量巴戟天组;D:中剂量巴戟天组;E:高剂量巴戟天组。

2.2 5组小鼠软骨细胞悬液中软骨细胞凋亡率比较

对照组、模型组以及低、中、高剂量巴戟天组小鼠软骨细胞悬液中软骨细胞凋亡率分别为(14.42±1.53)%、(72.10±12.08)%、(50.47±12.90)%、(33.84±5.21)%、(26.60±3.47)%。模型组和低、中、高剂量巴戟天组小鼠软骨细胞悬液中软骨细胞凋亡率显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);低、中、高剂量巴戟天组小鼠软骨细胞悬液中软骨细胞凋亡率显著低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。中、高剂量巴戟天组小鼠软骨细胞悬液中软骨细胞凋亡率显著低于低剂量巴戟天组,差异有统计学意义(P<0.05)。高剂量巴戟天组小鼠软骨细胞悬液中软骨细胞凋亡率显著低于中剂量巴戟天组,差异有统计学意义(P<0.05)。结果见图2。

A:对照组;B:模型组;C:低剂量巴戟天组;D:中剂量巴戟天组;E:高剂量巴戟天组。

2.3 5组小鼠软骨细胞悬液中Beclin1、LC3B、p-Akt、p-PI3K蛋白表达比较

模型组和低、中剂量巴戟天组小鼠软骨细胞悬液中Beclin1、LC3B、p-PI3K、p-Akt蛋白相对表达量显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);高剂量巴戟天组与对照组小鼠软骨细胞悬液中Beclin1、LC3B、p-PI3K、p-Akt蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。低、中、高剂量巴戟天组小鼠软骨细胞悬液中Beclin1、LC3B、p-PI3K、p-Akt蛋白相对表达量显著高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。中、高剂量巴戟天组小鼠软骨细胞悬液中Beclin1、LC3B、p-PI3K、p-Akt蛋白相对表达量显著高于低剂量巴戟天组,差异有统计学意义(P<0.05)。高剂量巴戟天组小鼠软骨细胞悬液中Beclin1、LC3B、p-PI3K、p-Akt蛋白相对表达量显著高于中剂量巴戟天组,差异有统计学意义(P<0.05)。结果见表1和图3。

表1 5组小鼠软骨细胞悬液中Beclin1、LC3B、p-PI3K、p-Akt蛋白相对表达量比较Tab.1 Comparison of relative expression levels of Beclin1,LC3B,p-PI3K and p-Akt protein in chondrocytes suspension of mice among the five groups

A:对照组;B:模型组;C:低剂量巴戟天组;D:中剂量巴戟天组;E:高剂量巴戟天组。

2.4 5组小鼠软骨细胞悬液中p-PI3K、p-Akt mRNA相对表达量比较

模型组和低、中剂量巴戟天组小鼠软骨细胞悬液中p-PI3K、p-Akt mRNA相对表达量显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);高剂量巴戟天组与对照组软骨细胞悬液中p-PI3K、p-Akt mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。低、中、高剂量巴戟天组软骨细胞悬液中p-PI3K、p-Akt mRNA相对表达量显著高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。中、高剂量巴戟天组小鼠软骨细胞悬液中p-PI3K、p-Akt mRNA相对表达量高于低剂量巴戟天组,差异有统计学意义(P<0.05)。高剂量巴戟天组软骨细胞悬液中p-PI3K、p-Akt mRNA相对表达量显著高于中剂量巴戟天组,差异有统计学意义(P<0.05)。结果见表2。

表2 5组小鼠软骨细胞悬液中p-PI3K、p-Akt mRNA相对表达量比较Tab.2 Comparison of the relative expression levels of p-PI3K and p-Akt mRNA in chondrocytes suspension of mice among the five groups

3 讨论

骨关节炎是骨科临床常见关节病,目前尚难早期发现骨关节炎患者骨关节中的生物学改变[11]。巴戟天是茜草科巴戟天属植物巴戟天的干燥根,在中医临床尤其是在抗炎治疗中得到了广泛应用[12]。研究显示,巴戟天提取物能呈剂量依赖性抑制促炎介质环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)、IL-1β、IL-6的表达,降低诱导型一氧化氮合酶蛋白表达并抑制核因子κB核转位,这些促炎因子往往在骨关节炎患者外周血呈高表达状态,是骨关节炎疾病进展的关键因子[13],因此,巴戟天有可能在骨关节炎的治疗中发挥一定作用。在骨关节炎的疾病恶化过程中,骨关节软骨细胞凋亡、自噬可能是影响疾病发展的关键生物学进程。因此,本研究通过建立骨关节炎小鼠模型,观察巴戟天对软骨细胞凋亡、自噬及其相关信号通路的影响,探讨巴戟天治疗骨关节炎的效果及其可能机制。

在发生骨关节炎时,软骨细胞会受到趋化因子CXC家族、IL-1、肿瘤坏死因子-α等多种炎症因子等的刺激[14],激活一氧化氮信号通路、死亡受体信号通路及PI3K/Akt信号通路多种途径参与骨关节炎发病过程[15-17]。其中,PI3K/Akt信号通路在影响软骨细胞的凋亡及自噬的发生发展过程中起着非常重要的作用。研究表明,当机体内炎症因子大量聚集,会导致PI3K/Akt信号通路被抑制,同时软骨细胞的凋亡水平显著增加[18]。因此,PI3K/Akt信号通路稳定与否与骨关节炎的病理发展密切相关,维持PI3K/Akt信号通路的稳定可以有效阻止骨关节炎发生发展。本研究结果显示,与对照组比较,模型组小鼠软骨组织及软骨细胞悬液中软骨细胞凋亡率均显著增高,同时,模型组小鼠软骨细胞悬液中p-PI3K、p-Akt蛋白相对表达量及p-PI3K、p-Akt mRNA相对表达量显著低于对照组,提示骨关节炎小鼠软骨细胞中PI3K/Akt信号通路表达被显著抑制,从而促进细胞凋亡;而低、中、高剂量巴戟天组小鼠软骨组织及软骨细胞悬液中软骨细胞凋亡率显著低于模型组,中、高剂量巴戟天组小鼠软骨组织及软骨细胞悬液中软骨细胞凋亡率显著低于低剂量巴戟天组,高剂量巴戟天组小鼠软骨组织及软骨细胞悬液中软骨细胞凋亡率显著低于中剂量巴戟天组,结果显示,经过巴戟天干预后,骨关节炎小鼠软骨组织中软骨细胞凋亡被显著抑制,且存在剂量依赖性;同时,低、中、高剂量巴戟天组小鼠软骨细胞悬液中p-PI3K、p-Akt蛋白相对表达量及p-PI3K、p-Akt mRNA相对表达量显著高于模型组,中、高剂量巴戟天组小鼠软骨细胞悬液中p-PI3K、p-Akt蛋白相对表达量及p-PI3K、p-Akt mRNA相对表达量显著高于低剂量巴戟天组,高剂量巴戟天组小鼠软骨细胞悬液中p-PI3K、p-Akt蛋白相对表达量及p-PI3K、p-Akt mRNA相对表达量显著高于中剂量巴戟天组,高剂量巴戟天组与对照组小鼠软骨细胞悬液中Beclin1、LC3B、p-PI3K、p-Akt蛋白相对表达量及p-PI3K、p-Akt mRNA相对表达量比较差异无统计学意义;提示,巴戟天干预激活了PI3K/Akt信号通路,使骨关节炎小鼠软骨细胞中p-PI3K、p-Akt蛋白相对表达量及p-PI3K、p-Akt mRNA相对表达量显著上调,且存在剂量依赖性。

PI3K被激活后会募集和激活下游信号分子Akt使其磷酸化水平增加,Akt被PI3K 激活后会促使下游炎症因子的活化,这些磷酸化底物活化后会促进细胞的自噬[19],在这一过程中下游自噬相关基因Beclin1及LC3B的表达往往会呈显著上升趋势。Beclin1 是自噬的关键调节因子,可通过调节磷脂酰肌醇-3磷酸的生成并协调自噬体的形成来控制自噬过程[20]。自噬的激活可伴随 Beclin1上调及溶酶体活性增加[21]。LC3B被认为是哺乳动物的自噬体标志物,也是检测自噬激活最常用的标志物,其可与自噬小体外膜紧密结合,并在溶酶体中被转运和降解,其含量与自噬泡的数量呈正相关[22]。在自噬过程中,自噬体包裹受损细胞器并与溶酶体结合,形成自噬溶酶体,此时LC3B将与自噬体膜相解离[23]。当自噬过程被抑制,LC3B 及 Beclin1 的表达会明显下调[24]。本研究结果显示,与对照组鼠相比,模型组小鼠软骨细胞悬液中自噬相关基因Beclin1、LC3B 的蛋白表达显著降低,提示细胞自噬水平降低;而给予巴戟天干预后,低、中、高剂量巴戟天组小鼠软骨细胞悬液中Beclin1、LC3B蛋白相对表达量显著高于模型组,中、高剂量巴戟天组小鼠软骨细胞悬液中Beclin1、LC3B蛋白相对表达量显著高于低剂量巴戟天组,高剂量巴戟天组小鼠软骨细胞悬液中Beclin1、LC3B蛋白相对表达量显著高于中剂量巴戟天组;提示巴戟天干预可增加骨关节炎小鼠软骨细胞的自噬水平,且与巴戟天浓度存在剂量依赖性。

4 结论

巴戟天能促进骨关节炎小鼠软骨细胞的自噬,抑制软骨细胞凋亡,从而减轻骨关节炎的发展;其药理学作用可能是通过调控PI3K/Akt信号通路而实现的,巴戟天有可能作为骨关节炎的临床治疗药物。