液相色谱-串联高分辨质谱法测定动物源性食品中去氢表雄酮残留量

王舒婷，李嘉，程用斌，吴晓红，张婷，凌莉

（陕西省农业检验检测中心，西安 710003）

去氢表雄酮(DHEA)，又名脱氢表雄酮、普拉睾酮、普拉雄酮，CAS号为w53-43-0，分子结构式如图1 所示。DHEA 是一种神经甾体类化合物，由人体肾上腺皮质所分泌，是人体合成的多种性激素的前体物质，具有雄性激素作用，可提高体内睾酮水平[1]。DHEA 具有抗衰老、抗抑郁、增强免疫功能和改善性功能等作用，临床上常用于糖尿病、肥胖症、免疫系统混乱、老年痴呆症、动脉硬化症以及癌症的治疗[2-5]。DHEA 还具有蛋白同化作用，能促进脂肪分解代谢、改善肌肉品质，同时对动物机体的蛋白代谢和神经系统也有较好的调节作用[6-9]。但作为内源性的食源性兴奋剂，DHEA 是世界反兴奋剂机构(WADA)禁止运动员使用的一种蛋白同化制剂，被列入“世界反兴奋剂条例国际标准”禁用清单[10]。2021年，“中华人民共和国第十四届运动会”将食源性兴奋剂的检测作为运动员保供食品质量安全的重点工作，对准确、快速检测动物源性食品中DHEA残留量提出了新的要求。

图1 去氢表雄酮分子结构式

目前，国内外对于DHEA的研究报道颇多[11-27]，检测方法主要有化学发光免疫分析法[13-14]、荧光光度法[15]、高效液相色谱法[16-17]、气相色谱-质谱法[18-19]以及液相色谱-质谱法[20-24]。以上方法检测基质多为血清、尿液、头发、鼠脑组织、土壤、饲料以及药物等[25-27]，而对动物源性食品中DHEA 残留量检测的报道较少[28]，GB/T 21981—2008 中规定了猪肉、猪肝、鸡蛋、牛奶、牛肉、鸡肉和虾等动物源食品中DHEA等多种激素残留量的液相色谱-质谱/质谱测定方法[28]，该法样品处理繁琐，检测周期长。笔者对动物源性食品猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉和鸭肉的样品处理方法进行研究，采用超高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱法(UHPLC-MS/MS)测定动物源性食品中DHEA残留量，为快速、高效、准确测定运动员专供动物源性食品中DHEA 残留量提供方法和技术参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

超高效液相色谱仪：UltiMate 3000型，美国赛默飞世尔科技公司。

高分辨质谱仪：Q Exactive Focus 型，美国赛默飞世尔科技公司。

固相萃取装置：HVF-1000型，陕西奥联科技发展有限公司。

电子天平：BP221S型，感量为0.1 mg，德国赛多利斯公司。

全自动氮吹浓缩仪：AutoEVA-20Plus 型，睿科集团股份有限公司。

冷冻离心机：3-18KS型，德国西格玛公司。

多管旋涡混匀仪：iswix MV 型，艾斯玛特仪器贸易有限公司。

组织研磨机：德国艾卡公司。

超纯水仪：DU 12FV型，泽拉布仪器科技(上海)有限公司。

固相萃取小柱：Oasis Prime HLB 型，3 mL/150 mg，美国沃特世公司。

尼龙微孔滤膜：孔径为0.22 µm，天津领航实验设备公司。

去氢表雄酮标准溶液：100 µg/mL，溶剂为甲醇，天津阿尔塔科技有限公司。

去氢表雄酮-D5标准物质：质量分数不小于98%，美国Iso Sciences公司。

甲醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷：质谱纯，赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

甲酸：质谱纯，美国霍尼韦尔公司。

无水硫酸钠、氯化钠：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司。

C18(十八烷基硅烷)：粒径为40～60 µm，天津博纳艾杰尔科技有限公司。

动物源性食品样品：猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉和鸭肉，均为市售。

实验用水为超纯水。

1.2 溶液配制

DHEA-D5标准储备液：1 mg/mL，准确称取适量去氢表雄酮-D5(精确至0.01 mg)，用甲醇溶解、定容，于-18 ℃以下避光冷冻保存，有效期为12个月。

同位素内标使用液：1 μg/mL，准确移取DHEAD5标准储备液10 µL 于10 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至标线。

DHEA 标准中间液：1 μg/mL，准确移取DHEA标准溶液100 µL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至标线。

1.3 样品处理

取动物源性食品样品约500 g，剔除筋膜和脂肪，用组织研磨机绞碎，装入洁净容器中并密封，于-18 ℃以下冷冻保存。准确称取预处理好的样品(5.00±0.01) g 于50 mL 具塞离心管中，加入同位素内标使用液100 µL (上机浓度为100 ng/mL)，加入20 mL 乙腈，涡旋振荡提取10 min，于4 ℃下以8 000 r/min 转速冷冻离心5 min，吸取上清液10 mL，转移至另一洁净的50 mL 具塞离心管中，依次加入4 g 无水硫酸钠、1 g 氯化钠和200 mg C18，涡旋1 min，加入15 mL 乙腈饱和正己烷溶液，涡旋1 min，于4 ℃下以8 000 r/min转速冷冻离心5 min，取乙腈层，过Oasis Prime HLB 柱净化，收集净化液，于40 ℃氮气中吹至近干，准确加入0.5 mL乙腈-水(体积比为1∶1)溶液，涡旋振荡1 min，超声溶解1 min，过0.22 µm 尼龙微孔滤膜，供高效液相色谱-串联质谱仪检测。

空白基质制备：称取阴性组织样品(5.00±0.01) g于50 mL具塞离心管，除不添加内标溶液外，其余操作同样品处理步骤。

1.4 仪器工作条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱：Hypersil GOLD-C18毛细管柱(50 mm×2.4 mm，1.9 μm，美国赛默飞世尔科技公司)；流动相：0.1% (体积分数，下同)甲酸溶液(A)和甲醇(B)，流量为0.4 mL/min；淋洗方式：梯度洗脱，0～1 min时保持5% B，1～2 min 时5%～20% B，2～6 min 时20%～65% B，6～8 min 时65%～85% B，8～8.5 min时85%～100% B；8.5～11 min 时100% B，11～11.1 min 时100%～5% B，11.1～15 min 时5% B；进样体积：5.0 μL；柱温：40 ℃；定性方法：采用保留时间和相对离子丰度比双重定性；定量方法：内标法。

1.4.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描(PRM)；监测方式：平行反应监测(PRM)；电离电压：3.5 kV；鞘气流量：50 L/min；吹扫气流量：10 L/min；离子源温度：300 ℃。离子对优化参数见表1。

表1 DHEA和DHEA-D5的质谱、色谱参数

2 结果与讨论

2.1 液相色谱条件优化

2.1.1 色谱柱

分别比较了Sllim-pack GIST-HP C18柱(100 mm×2.1 mm，3.0 μm，日本岛津公司)、Accucore RPMS 柱(100 mm ×2.1 mm，2.6 μm，美国赛默飞世尔科技公司)、Hypersil GOLD-C18柱(50 mm×2.4 mm，1.9 μm，美国赛默飞世尔科技公司)、XBridge C18柱(100 mm ×2.1 mm，3.5 μm，美国沃特世公司) 4种色谱柱对目标物的分离效果。由于样品基质中存在一种质荷比与目标物接近的强干扰物质，因此选择PRM模式扫描并动态排除，将干扰物锁定不触发二级碎裂，以此屏蔽干扰。结果表明：四种色谱柱对目标物均响应良好。综合考虑，选用Hypersil GOLDC18色谱柱为分离柱，图2为DHEA和DHEA-D5标准溶液的色谱图。

图2 DHEA和DHEA-D5标准溶液色谱图

2.1.2 流动相

以Hypersil GOLD-C18柱为分析柱，考察不同流动相对目标物和干扰物质的分离效果。以纯水为流动相A，甲醇为流动相B，分别对比了在A相中加入酸或缓冲盐的效果。结果表明，A相为0.1%甲酸溶液时，目标化合物的保留时间、分离度、色谱峰形、灵敏度等均优于纯水和添加挥发性缓冲盐乙酸铵，因此，选择A 相为0.1%甲酸溶液，B 相为甲醇作为流动相。

2.1.3 柱温

柱温对梯度洗脱和单组分目标物的分析影响不大，参考文献[22]和文献[28]选择柱温为40 ℃，DHEA的色谱保留时间、峰形、灵敏度等均较理想。

2.2 质谱条件优化

所用高分辨LC-MS/MS 仪将四极杆的母离子选择性与高分辨率的精确质量数(HR/AM)OrbitrapTM 检测技术相结合，可得到小数点后4 位的精确质量数，因此，对化合物的定性和定量更加准确可靠。

由于同位素内标自然丰度较低，样品中不会存在，且内标物与待测物有相同的分子结构和性质，两者色谱出峰时间相近，但由于相对分子质量不同，能与样品中待测组分完全分离，可有效消除基质干扰，降低离子化效应的影响，因此采用DHEA-D5同位素内标。定量加入同位素内标极大程度地降低了目标物在提取、净化、进样时的随机误差、偶然误差所导致的数据偏离，有效提高了准确度和精密度。

DHEA 既可以用电喷雾离子源(ESI)电离，也可以用大气压化学电离源(APCI)分析，试验采用ESI正离子模式作为其离子化方式，取1.0 μg/mL 的DHEA和DHEA-D5混合标准溶液，采用微量蠕动泵连续进样，进行一级质谱全扫描，确定准分子离子。结果显示，DHEA和DHEA-D5在正离子模式下可获得准分子离子峰。将母离子作为准分子离子，进行二级质谱扫描，选择丰度最高的两个特征碎片离子作为定性离子和定量离子，并优化相应离子对的碰撞能量和透镜电压，优化结果见表1。选用[M+H]+作为母离子，m/z289.216 是DHEA 的加氢峰，m/z271.205 和m/z253.195 是[M+H]+的系列脱水峰，选择丰度较高的m/z271.205作为DHEA定量子离子，m/z253.195作为定性子离子。对于DHEA-D5，[M+H]+为母离子，m/z294.247 是DHEA-D5的加氢峰，m/z276.237和m/z258.227是[M+H]+的系列脱水峰，选择丰度较高的m/z276.237 作为定量离子，m/z258.227 作为定性离子。图3 为DHEA 和DHEA-D5的[M+H]+二级质谱图。

图3 DHEA和DHEA-D5二级碎片质谱图

动物源性食品基质复杂、干扰大，我国对动物源性食品中DHEA 控制限量低(不大于5 µg/kg)，且在分析过程中存在一种质荷比与DHEA 很接近的强干扰物质，查阅文献得知此干扰物质可能是聚丙二醇(PPG)[29]，其质荷比为289.141182，PPG 可用来制备增塑剂，样品处理过程用的离心管、移液器枪头、注射器、滴管、微孔滤膜等耗材均为塑料制品，在有机溶剂作用下，PPG同DHEA一起被提取出来，因此造成干扰。选择PRM模式扫描、动态排除将干扰物锁定不触发二级碎裂，从而屏蔽掉此干扰物质，避免影响测量准确度及出现假阳性结果。

2.3 样品处理条件优化

2.3.1 提取溶剂选择

分别比较了二氯甲烷和乙腈的提取效果。当添加水平为4.0 µg/kg 时，乙腈提取DHEA 回收率为87.7%～104.6%，二氯甲烷提取DHEA 回收率为62.2%～76.5%；当添加水平为8.0 µg/kg 时，乙腈提取DHEA 回收率为95.8%～105.3%，二氯甲烷提取DHEA回收率为68.2%～82.4%。结果表明，采用乙腈提取效果显著优于二氯甲烷，因此采用乙腈作为提取溶剂。

2.3.2 净化方式

与GB/T 21981—2008相比，本实验样品净化方法在时间、耗材使用上均显示出相对优势。GB/T 21981—2008 方法的样品净化使用ENVI-Carb 固相萃取柱和氨基柱，需要提前对柱子进行活化、洗脱；本实验样品处理方法采用Oasis Prime HLB柱，该柱无需活化、淋洗、洗脱，可直接上样收集过柱液，样品处理速度提升了约30%，大幅节省了样品处理时间，满足快速、批量检测体育赛事中运动员专供动物源性食品中DHEA残留量的要求。

2.4 线性方程与检出限

在空白基质中添加适量DHEA 标准中间液和同位素内标使用液，配制成DHEA的质量浓度分别为2、5、10、25、50、100、250 ng/mL 的系列标准工作溶液，其中同位素内标DHEA-D5的质量浓度均为100 ng/mL。按照1.4 仪器工作条件，将上述系列标准工作溶液重复测定3 次，以目标组分色谱峰面积与内标色谱峰面积之比为纵坐标，对应的质量浓度为横坐标，绘制校准工作曲线，计算得线性方程为y=0.004 09x-0.004 94，相关系数为0.999 9，质量浓度线性范围为2～250 ng/mL。

将适量DHEA 标准工作溶液加入空白基质中，经微孔滤膜过滤后上机测定，依据特征离子色谱峰的信噪比等于3对应的样品中DHEA的质量分数为方法检出限，信噪比等于10对应的样品中DHEA的质量分数为方法定量限，得DHEA的检出限和定量限分别为2.0、4.0 μg/kg。

2.5 加标回收与精密度试验

根据《十四运会和残特奥会食源性兴奋剂检测工作方案》中食源性兴奋剂控制限量要求，DHEA的限量为5.0 μg/kg，按照定量限、2 倍定量限和2 倍控制限量浓度水平进行添加回收试验，每个添加水平平行测定5次，考察DHEA的回收率和测量精密度，测定结果见表2。

表2 加标回收与精密度试验结果

由表2 可知，不同基质中的DHEA 在4.0～10.0 μg/kg添加水平时的平均回收率为85.4%～100.3%，相对标准偏差为1.9%～6.8%。表明该方法精密度、准确度良好。图4为牛肉空白样品基质及加标样品的色谱图。

3 结语

利用液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱法测定动物源性食品中DHEA 残留量，采用乙腈提取、Oasis Prime HLB柱净化样品，优化了液相色谱和质谱条件，采用PRM扫描模式可以将基质中的干扰物质去除，采用同位素内标法进行定量分析，方法回收率高、精密度良好。该方法样品处理简单，分析灵敏度高，定性精准，可广泛应用于动物源性食品中兴奋剂DHEA残留量的检测。