革兰染色与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱应用于鉴定儿童阳性血培养病原菌种类中的价值

白 羽

福建省泉州市第一医院检验科 362000

血流感染是临床常见的感染性疾病,有较高的发病率和致死率,全球每年发生血液感染的近20万患儿中,病死率可达10%～20%,给患儿的生命安全带来极大威胁[1]。因此当患儿出现疑似血流感染时,需要尽快明确病原菌种类,根据药敏的不同特点给予其相对应的抗菌药物,不仅能够控制血流感染速度,挽救患儿生命,同时能够降低患儿家庭经济负担提高生存率。临床常以转种培养后的鉴定结果作为血流感染的金标准,但由于培养较困难,同时培养报阳后传统的转种和生化表型鉴定方法至少需要48h,结果判定耗时长等原因受到诸多限制,无法做到快速评估。革兰染色方法是基于细菌细胞壁中肽聚糖之间的反应,用染剂固定颜色,使细胞脱色,并进行复染。但脱色过度或不足时,可能会改变结果,同时脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响,难以严格规定[2]。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在细菌不经过前处理的情况下直接检测细菌[3],以上两种方式在临床应用较为广泛,因此本研究旨在分析革兰染色及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在检测儿童阳性血培养病原菌中的价值,现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2021年1月1日—2022年12月31日期间在我院送检的儿童阳性血培养瓶153例作为研究对象,所收集标本由我院工龄满5年的检验技师根据双盲法阅片并进行病原菌判断。本研究经医院医学伦理委员会审核批准。家属签署知情同意书。纳入标准:(1)本研究所纳入的患儿在临床中均诊断为血流感染;(2)儿童年龄在3～10岁;(3)所纳入的标本均为阳性血培养。排除标准:(1)患儿合并其他基础性疾病;(2)阳性血培养瓶污染;(3)合并其他免疫系统疾病者。

1.2 方法 转种培养:使用1ml的无菌注射器抽取0.5ml儿童血培养瓶中的液体,将其接种于血琼脂平板中,放置于36℃,5%的CO2培养箱中,培养24h,再使用质谱仪对单个菌落进行鉴定,其中仪器的使用按照说明书进行。

革兰染色:使用1ml的无菌注射器抽取0.5ml儿童需氧血培养瓶中的液体涂片固定,通过草酸结晶紫初染1min,用水冲洗。加碘液覆盖样本涂面媒染1min,用水冲洗,滴加95%乙醇,轻轻摇动脱色30s,用水冲洗,用吸水纸将水吸干,复红染液复染1min,用水冲洗,用吸水纸将水吸干,最后行镜检观察。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱培养:使用1ml的无菌注射器抽取0.5ml儿童需氧血培养瓶中的液体,前期处理通过运用Sepsityper Kit试剂盒。具体操作:将1ml的阳性血培养瓶中的液体放入eppendorf管中,再加入200μl的Buffer,通过涡旋震荡10s,混匀离心2min,弃去上清,在沉淀中再加入1ml的洗涤缓冲液,涡旋震荡30s直至沉淀完全溶解,离心1min,弃去上清,取沉淀,并在沉淀中加入MS-DS靶板,再加入1μl的MSCHCA基质,静置至表面干燥,上机鉴定。结果的判定:绿色为唯一鉴定结果,可行度为60%～99%,黄色为低分辨结果可行度为>60%,红色表示无法鉴定,可信率<60%,与数据库的质谱数据不匹配,重新检测。

1.3 观察指标 以转种培养后的鉴定结果为金标准,均采用革兰染色与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱培养,分析革兰染色与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对阳性血培养病原菌的检出率、两种方式单独与转种培养后鉴定结果的一致性以及对儿童阳性血培养病原菌种类的诊断效能(灵敏度、特异度、准确度)。(1)转种培养后的鉴定结果对儿童阳性血培养病原菌种类的检出率。(2)革兰染色与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱与转种培养后的鉴定结果诊断的一致性:Kappa值<0.4表示检测方式与金标准的诊断一致性较差,0.4≤Kappa值<0.75表示检测方式与金标准的诊断一致性尚可,0.75≤Kappa值≤1.0表示检测方式与金标准的诊断一致性较好。(3)革兰染色与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对儿童阳性血培养病原菌种类的诊断价值:以转种培养后的鉴定结果为金标准,分析两种方式对儿童阳性血培养病原菌种类的诊断符合率、灵敏度、特异度。

1.4 统计学方法 采用SPSS22.0统计软件进行数据分析,计数资料以率表示,采用χ2检验;一致性分析采用Kappa检验;P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 单一菌样本革兰染色与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测鉴定结果比较 共收集153例阳性儿童血培养样本,其中单一菌样本143例(93.46%),两种菌样本10例(6.54%)。153例样本中,检出革兰阳性菌133株(86.93%)中以金黄色葡萄球菌最多(61.1%);革兰阴性菌20株(13.07%)中以肠杆菌科细菌最多(60.00%)。

2.2 革兰染色与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对病原菌种类的诊断效能对比 153例儿童阳性血培养病原菌中以转种培养后的鉴定结果为判断标准,确定133例儿童阳性血培养病原菌为革兰阳性菌,20例为革兰阴性菌,其中革兰染色检测与转种培养结果诊断标准一致性尚可(Kappa=0.501);基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱与转种培养结果诊断标准一致性好(Kappa=0.826),见表1。

表1 革兰染色与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对病原菌种类的诊断效能对比(n)

2.3 革兰染色与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测对单一病原菌种类的诊断价值对比 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱诊断病原菌种类的特异度、敏感度及诊断准确率高于革兰染色诊断(P<0.05),见表2。

表2 革兰染色与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测对单一病原菌种类的诊断价值对比(%)

3 讨论

血流感染作为严重的感染性疾病,死亡率较高,对于血流感染患儿而言,推迟1h使用抗生素进行合理治疗,会降低患儿的存活率[4]。因此对血培养结果监测,了解血液感染病原菌分布,可以更好地帮助和指导临床科学合理用药,保障患儿的生命安全。临床通常选择转种培养后的鉴定结果作为血流感染的金标准,但因其培养耗费时间较长,同时从血液中所分离的病原菌在后期形成可视菌落过程较慢,无法作为临床快速判断的检测方法[5]。目前随着检测技术的发展,分子生物等检测方式相对简单,检测时长较短,逐渐得到检验科及门诊工作者的重视。革兰染色可以观察到细菌的形态、排列及结构特征,但分辨度较低,操作烦琐,不能准确区分细菌种属,无法完全准确指导临床抗生素的合理使用[6]。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在操作上简便、大规模、并行化和高度自动化处理待检生物样品,在测定生物大分子和合成高聚物应用方面有特殊的优越性[7]。

本文收集153例阳性儿童血培养样本,其中单一菌样本143例(93.46%),两种菌样本10例(6.54%)。153例样本中,革兰阳性菌中以金黄色葡萄球菌最多(61.1%);革兰阴性菌中以肠杆菌科细菌最多(60.00%);153例儿童阳性血培养病原菌中以转种培养后的鉴定结果为判断标准,确定133例儿童阳性血培养病原菌为革兰阳性菌,20例为革兰阴性菌,其中革兰染色检测与转种培养结果诊断标准一致性尚可(Kappa=0.501);基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱与转种培养结果诊断标准一致性好(Kappa=0.826);基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱诊断病原菌种类的特异度、敏感度及诊断准确率均高于革兰染色诊断(P<0.05),说明基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测诊断价值更高。可能的原因是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱不仅能鉴定区分临床中速分离出的菌落,同时也能够对临床中未经分离的标本进行鉴定,相较于常规鉴定方法此种方法能够缩短细菌鉴定时间。其次,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱是通过判断分子量的差异进行感染细菌的检测,将琼脂板中生长的党菌落点涂在靶板上,在基质溶液充分混匀后,在质谱仪内接受多次激光照射,在电荷解离的过程中,基质能够吸收激光并与菌体共同解吸,对菌株的鉴定率可达66%～97%,但处理阳性血培养液通常需要较为烦琐的人工操作才能获得足量、纯化的病原菌蛋白[8]。再次,通过病原菌富集技术处理阳性血培养样本后直接用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行鉴定,将极大地提高鉴定速度,缩短报告时间,满足临床快速诊断的需求。同时,质谱技术能够鉴定出复数菌中一种,未发现有鉴定错误的情况。传统的生化检测方法或基因测序方法在实验整体操作中对于无菌要求较高,污染对结果的影响较大,而基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱则能保证一定的“容错性”[9]。有研究发现[10],当感染多种菌且革兰染色无法分辨时,两种评分较高的不同种类菌群的质谱鉴定结果是一个宝贵的提示。这在本研究中也得到了同样的印证。曹敬荣等人研究表明[11],通过运用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定固体培养基短期培养后的血流感染病原菌,仅需2.5h即可鉴定且准确率可达到58.3%,通过5.5h的培养鉴定准确率能达82.3%,表明基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在鉴定血培养阳性方面较有优势,培养时间短,节省了检测时间,利于早期诊断。

综上所述,革兰染色与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检查均可对儿童阳性血培养病原菌进行检出,且革兰染色与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测诊断价值更高。