粉尘螨Der f 38的结构与免疫优势表位的生物信息学预测分析*

曾小飞 杨钰欢 柳嘉玮 鲁 陈

1 赣南医学院第一临床医学院,江西省赣州市 341000; 2 江苏省肿瘤医院药学部; 3 赣南医学院第一附属医院精准医学中心

螨虫是最常见的致敏物质之一,全球约有6 500万～1.3亿对其过敏的患者,在哮喘患者中螨虫的过敏率高达50%[1-2]。迄今为止,已有40种不同组别的螨虫过敏原,被鉴定且收录在过敏原命名委员会数据库中。粉尘螨Der f 38是在2021年被鉴定具有Toll样受体4结合活性的溶菌酶样蛋白,其在螨虫过敏患者中的致敏率为60%～75%[3],是一个重要的过敏原分子。过敏原特异性免疫疗法(AIT)有别于其他治疗方法,其疗效被多项临床试验证实[4]。传统免疫治疗中使用的螨虫过敏原疫苗,是从螨虫中提取的混合物质,成分变异大、标准控制难、容易出现不良反应[5]。重组过敏原及其低致敏活性的衍生物,展现出更有前景、更安全和有效的优势[6],此类治疗药物或疫苗的开发,需要对过敏原的性质、结构和免疫优势表位有充分的了解。本研究通过综合生物信息学工具,对螨虫过敏原Der f 38进行理化性质、结构特征、优势B细胞表位和T细胞表位的预测分析,为进一步针对该过敏原的个体化免疫治疗提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 Der f 38蛋白的序列检索以及理化性质分析 从世界卫生组织/国际免疫学会联合会过敏原命名数据库(http://www.allergen.org/)中检索获取Der f 38的氨基酸序列,该序列在GenBank中的登记号为QHQ72282.1。根据所获得的Der f 38氨基酸序列信息,通过SignalP-5.0预测其信号肽序列(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0),使用ProtParam分析除去信号肽后的序列,获取成熟蛋白质的分子量、氨基酸组成、正负电荷残基、不稳定指数等理化性质。

1.2 Der f 38蛋白的二级与三级结构分析 Der f 38蛋白的二级结构预测主要通过DNAStar软件完成。三级结构预测通过同源建模的SWISS-MODEL[7]和人工智能深度学习的AlphaFold2[8]两种方法来实现。在SWISS-MODEL中 (https://swissmodel.expasy.org/),提交成熟Der f 38蛋白的氨基酸序列进行模型构建,在结果中选取序列覆盖率最广、序列一致性最强、全局模型质量评估(GMQE)最高的模型进行下一步分析。在AlphaFold2中,提交氨基酸序列后,选择系统评分最佳的模型进行后续分析。

利用SAVES v6.0(https://saves.mbi.ucla.edu/)对不同方法构建的Der f 38模型进行准确性和有效性测试:通过PROCHECK评估模型结构的立体化参数[9],Verify3D评估蛋白结构的三维轮廓,与其自身氨基酸序列的匹配性[10],ERRAT评估特征原子间相互作用的分布方式[11]。根据评分结果,选择最佳的模型,进一步利用GalaxyRefne服务器(http://galaxy.seoklab.org/)对模型进行优化。优化后的模型用上述评分系统进行验证,最终将优化后的模型用Pymol(https://pymol.org/2/)展示,并分析Der f 38的结构特征。

1.3 Der f 38蛋白的优势B表位预测分析 B细胞表位分为线性表位和构象表位,线性表位又称连续性表位,一般由抗原表面几个连续的氨基酸组成[12]。Der f 38蛋白的线性表位预测通过综合3种不同的免疫信息学工具进行,即Bepipred 2.0、ElliPro、DNAStar protean。在Bepipred 2.0(http://tools.iedb.org/bcell/)、ElliPro(http://tools.iedb.org/ellipro/)中对蛋白进行线性表位预测,在得分中选取高于0.5的结果作为线性表位。在DNAStar Protean中,选择同时满足亲水性、柔性、抗原性、可及性序列区域作为线性表位,综合这三种工具筛选出的线性表位结果。

构象表位是由序列上不相连的氨基酸残基通过折叠形成的空间结构。构象表位可通过DiscoTope 2.0线上网站预测,在DiscoTope 2.0 server (http://tools.iedb.org/discotope/)中,选择结果>-3.7的氨基酸作为参与形成B细胞构象表位的关键性残基。

1.4 Der f 38蛋白的T表位预测 Der f 38蛋白的T细胞表位预测主要通过TepiTool(http://tools.iedb.org/tepitool/)进行,选择IDEB推荐的预测方法[13],从预测的结果中选择具有活性的表位作为最终的MHC-Ⅱ表位。

2 结果

2.1 Der f 38蛋白的序列和理化性质 根据螨虫过敏原Der f 38的氨基酸序列信息,利用SignalP-5.0分析,显示Der f 38在20位和21位氨基酸之间存在切割位点,信号肽的可能性为99.88%。对Der f 38蛋白序列理化性质分析,其分子量为13.99kDa,分子式为C622H935N187O177S4,理论等电点(pI)为9.08,氨基酸中带负电荷的残基(Asp+Glu)有7个,带正电荷的残基有11个(Arg+Lys)。不稳定指数(Ⅱ)为31.79,亲水性指数(GRAVY)为-0.337,表明该蛋白具有一定的稳定性及亲水性。

2.2 Der f 38蛋白的二级与三级结构优化 在SWISS-MODEL同源预测中,RipA蛋白(编号为3ne0.1.A)与Der f 38蛋白的序列一致性为40%,且序列覆盖率高达83%,因此,以RipA蛋白为模板构建Der f 38蛋白的三级结构模型(见图1a)。在AlphaFold2预测中,选择置信度PLDDT最高的模型作为Der f 38蛋白的三级结构模型(见图1b)。通过SAVES v6.0服务器对两种方法预测出Der f 38的三级结构进行系统评分,SWISS-MODEL所得模型评分为96.85%,AlphaFold2所得模型评分为100%,即两种模型中都有超过80%的氨基酸残基,拥有>0.2的3D/1D值。ERRAT评分中SWISS-MODEL模型得分(92.308,见图1d)较AlphaFold2模型(82.645,见图1e)更佳。在PROCHECK的评分中,拉氏图提示SWISS-MODEL模型在不被允许的区域内存在氨基酸残基(见图1g),而AlphaFold2模型的所有氨基酸残基都落在优势区域或允许区域内(见图1h)。综合评分结果,应选择AlphaFold2模型进行结构优化。优化后的模型(见图1c)再次通过SAVES v6.0进行评分,相较于未优化模型各评分均有提升,ERRAT提示优化后模型的评分为100(见图1f),拉氏图结果(见图1i)提示优化后模型的所有氨基酸残基均在允许区域内,且在最佳区域的氨基酸残基增加,最终得到Der f 38蛋白的二级结构中含有4个α-螺旋结构和6个β-折叠结构。

图1 Der f 38蛋白的模型与评分

2.3 Der f 38蛋白的B表位 过敏原蛋白的B细胞表位鉴定是针对该蛋白进行治疗、疫苗设计与开发的重要环节。应用ElliPro、Bepipred 2.0、DNAStar protean三种方法预测线性B表位,DiscoTope 2.0预测构象B表位。通过输入Der f 38的三级结构,ElliPro预测出6个线性表位,其氨基酸位置处于43-59、71-78、83-101、107-113、127-133、135-144。输入Der f 38的氨基酸序列后,Bepipred 2.0输出4个线性表位,分别为:40-59、75-78、85-100、132-142,在DNAStar protean中,综合蛋白的亲水性、抗原性、表面可及性、柔韧性(见图2),预测出2个线性表位:98-101和126-136。将上述三种方法预测出的B表位取交集,收集至少两种方法预测出的氨基酸序列作为Der f 38最终的线性B表位,其位置分别为43-59、75-78、85-101、127-142(见表1)。DiscoTope 2.0预测出该蛋白中含有8个参与构象表位的氨基酸残基(见表2),在这8残基中,除了第34位氨基酸,剩余7个残基同时位于线性B表位区域,B表位在Der f 38蛋白的模型中的位置见图3。

表1 Der f 38线性B表位的氨基酸序列

表2 Der f 38参与形成构象B表位的关键氨基酸序列

图2 DNAStar分析的Der f 38蛋白的四种性质

图3 B细胞表位在Der f 38蛋白空间结构中的位置

2.4 Der f 38蛋白的T表位 在TepiTool中,选择DP、DR、DQ位点中最常见的26个等位基因与Der f 38蛋白的多肽进行结合,得出11个符合设定阈值的肽链,其中有8个与至少2条等位基因相结合,其氨基酸序列为21-35、66-80、72-86、77-91、103-117、108-122、113-127、136-150,具体的氨基酸序列以及与其结合的等位基因信息见表3。

表3 Der f 38的T表位筛选结果

3 讨论

螨虫是主要的致敏物质之一,可诱发敏感患者产生一系列的过敏症状[14]。重组过敏原的发现,促进了基于分子水平免疫治疗方法的发展,相较于传统的螨虫浸提物形式的治疗策略,基于过敏原单体及其衍生物进行个体化的给药,具有更好的安全性[15]。例如基于B细胞表位融合大分子的Der p 23低致敏疫苗表现出显著降低的致敏活性,并具有较好的免疫调节能力[16];使用B表位或T表位多肽片段是一种新的多肽免疫治疗策略[17]。因此,对过敏原的性质、结构和表位的分析,在新型脱敏治疗疫苗的开发中尤为必要。

螨虫中Der f 38是近年来发现的一类具有Toll样受体4结合活性的重要过敏原,其过敏率可达到60%[3]。在本研究中,首先根据螨虫Der f 38过敏原氨基酸序列分析其理化性质,表明该Der f 38属于亲水且稳定的碱性蛋白。为了进一步分析Der f 38的B细胞表位,使用经典SWISS-MODEL进行Der f 38三维结构的同源构建,同时也利用新型基于人工智能工具AlphaFold2进行同步比较[18],最终构建和评价结果也表明AlphaFold2更具有优势,该策略也为其他过敏原疫苗构建过程提供了新的基于人工智能方法的启发。Der f 38自身具有的Toll样受体4结合活性使其具有促炎症细胞浸润的作用[3],因此预测并分析Der f 38的表位有助于构建低不良反应的过敏原疫苗。根据Der f 38的氨基酸序列和AlphaFold2构建的三维结构模型,综合预测工具结果得到了4条位于Der f 38蛋白表面的B表位,同时预测得到的8个参与形成构象表位的关键残基,其中7个残基位于线性表位当中,这些结果为进一步组合构建Der f 38提供了重要的依据。为了避免过敏原疫苗中T细胞表位可能引起过敏原特异性T细胞活化的迟发性不良反应[19],T细胞的预测分析尤为重要。在TepiTool中分析得到8条候选T细胞表位,可帮助在设计B细胞表位疫苗时选择合适的多肽区域,达到进一步降低不良反应的目的。

综上所述,本研究通过对尘螨过敏原Der f 38的理化性质、B细胞和T细胞表位的分析,为其表位、多肽或融合蛋白疫苗的构建提供理论基础和设计方向,用于达到提高免疫治疗疗效、降低疫苗不良反应目的。