三合饮对AS模型小鼠主动脉斑块形成的影响及其作用机制的实验研究

黄超岚,谭露南,盛晓生,吴 杰,许维东

(金华市人民医院·浙江 金华 321015)

冠心病患病人数多、病死率高,对公众健康危害重大[1]。动脉粥样硬化(AS)是冠心病的主要病理基础,而炎症反应贯穿AS的各个阶段,期间巨噬细胞的活化致使AS斑块甚至机体处于微炎症状态,而且巨噬细胞还可导致斑块破裂[2-3];因此,调节巨噬细胞可能是延缓AS进展、增强斑块稳定性的重要途径之一。NOD样受体蛋白3(NLRP3)是一种信号转导蛋白复合体,研究报道,NLRP3炎症小体可促进斑块局部炎症反应、易损和破裂,而抑制其活化可阻滞AS进展[4]。疏肝通阳、活血滌痰法是冠心病的中医治法,三合饮为依此法组方的治疗冠心病经验方,可明显减少冠心病患者胸痛发作频率,长期服用可延缓病情进展[5]。本研究将从NLRP3炎症小体角度,分析三合饮稳定AS斑块的潜在机制,为临床冠心病的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级ApoE基因敲除小鼠(ApoE-/-)43只,同遗传背景普通C57BL/6J小鼠11只,雄性,8周龄,体质量18～22 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,动物许可证号:SCXK(京)2021-0006。

1.1.2 实验药物 三合饮:方由柴胡10 g,赤芍、炒枳壳、瓜蒌皮、法半夏各12 g,降香、薤白各9 g,丹参15 g,炙甘草6 g组成;上述中药由桐君堂提供,加水煎煮2次合并煎液。阿托伐他汀钙片:大连辉瑞制药公司,国药准字H20051407。

1.1.3 试剂 高脂饲料和普通饲料均购自睿迪生物科技(深圳)有限公司,货号D12108C;小鼠白细胞介素(IL-18、IL-1β)ELISA试剂盒:江苏酶免实业有限公司,货号MM-0169M2、MM-0040M2;免疫荧光共定位一抗NOD样受体蛋白3(NLRP3):美国Invitrogen公司,货号PA5-79740;一抗巨噬细胞抗体2(MOMA-2):美国Abcam公司,货号ab33451。

1.1.4 实验仪器 iMark酶标仪:美国Bio-Rad公司;FV3000型激光共聚焦显微镜:日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 AS模型的建立 所有小鼠以普通饲料适应性喂养1周,随后43只ApoE-/-小鼠用高脂饲料连续喂养10周,建立AS模型,11只普通C57BL/6J小鼠以普通饲料喂养。10周结束时,ApoE-/-小鼠和普通C57BL/6J小鼠各处死3只,判断造模是否成功。小鼠主动脉斑块显著增多,根部管壁增厚,提示AS模型构建成功。

1.2.2 动物分组与给药 40只AS模型小鼠随机分为AS组,三合饮低、中、高剂量组和阿托伐他汀组,每组8只,另取8只普通C57BL/6J小鼠作正常对照组。三合饮低、中、高剂量组分别以7.5、15.0、30.0 g/kg三合饮药液灌胃,每日1次,阿托伐他汀组以3 mg/kg阿托伐他汀钙片药液灌胃,每日1次,正常组和AS组予等量生理盐水替代,连续干预4周。

1.2.3 观察指标及检测方法

1.2.3.1 油红O染色评估小鼠主动脉斑块面积 末次给药后禁食不禁水24 h,腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥钠麻醉小鼠快速分离全心脏及主动脉根部,制备主动脉窦切片,行油红O染色,阳性染色即为斑块,以主动脉窦部横切面斑块面积占主动脉管腔面积的百分比表示斑块大小。取整条主动脉固定后纵向剖开,行油红O染色大体拍照,与主动脉大体面积比值百分比来代表主动脉大体斑块面积大小。

1.2.3.2 血清IL-18、IL-1β检测 末次给药后禁食不禁水24 h麻醉小鼠摘眼球取血,分离血清样本,采用双抗夹心ELISA检测IL-18、IL-1β水平,参照试剂盒说明书操作。

1.2.3.3 免疫荧光检测主动脉NLRP3和MOMA-2表达和共定位情况 取主动脉窦切片,置于破膜液处理30 min,再放入3%双氧水孵育30 min,然后滴加牛血清白蛋白工作液,孵育30 min,滴加1∶100一抗NLRP3、MOMA-2抗体,4 ℃下孵育过夜,滴加荧光二抗,37 ℃避光反应30 min,再避光DAPI染色10 min,最后添加放淬灭剂封片,于激光共聚焦显微镜下观测NLRP3、MOMA-2表达和共定位情况。

2 结果

2.1 三合饮对AS小鼠主动脉斑块形成的影响 与正常组比较,AS组小鼠主动脉窦斑块横断面面积占比明显增加(P<0.05);与AS组比较,三合饮低、中、高剂量组和阿托伐他汀组斑块横断面面积占比明显减少(P<0.05),以三合饮高剂量组减少最显著。见表1。与正常组比较,AS组小鼠全主动脉斑块面积占比明显增加(P<0.05);与AS组比较,三合饮低、中、高剂量组和阿托伐他汀组斑块面积占比明显减少(P<0.05),以三合饮高剂量组减少最显著。见表1。

表1 各组小鼠主动脉斑块的比较

2.2 三合饮对AS小鼠血清IL-18、IL-1β水平的影响 见表2。

表2 各组小鼠血清IL-18、IL-1β水平比较

2.3 三合饮对AS小鼠主动脉根部NLRP3和MOMA-2表达的影响 与正常组比较,AS组小鼠主动脉根部NLRP3、MOMA-2及共表达荧光活性明显升高(P<0.05);与AS组比较,三合饮中、高剂量组和阿托伐他汀组NLRP3、MOMA-2及共表达荧光活性明显降低(P<0.05),以三合饮高剂量组降低最显著。见表3。

表3 各组小鼠主动脉根部NLRP3和MOMA-2表达的比较

3 讨论

冠心病在中医学属于“胸痹”“心痛”等范畴,病位虽在心,然子病及母,心病则肝气往往不疏,又母病及子,肝郁气滞则血行不畅阻碍“心主血脉”,故临证强调“治心必调肝,肝气通则心气和”及“祛瘀化痰之时,不忘疏通胸阳之本”,因此提出“疏肝通阳、活血滌痰”法这一“双心同治”之法[6-7]。三合饮是程志清教授治疗冠心病的自拟经验方,以“四逆散”“瓜蒌薤白半夏汤”“丹参饮”三方合用,具有疏肝气、通心阳,活血滌痰疏痹的功效[8]。临床应用证实,三合饮可明显减少冠心病患者胸痛发作频率,改善抑郁状态,长期服用还可有效延缓AS进展[9],但相关作用机制尚不清楚。

AS斑块形成是AS最具特征性的病变,其中不稳定斑块是导致急性心血管事件的重要因素,此类斑块具有脂质核心大且柔软、炎性细胞浸润增多、纤维帽少而薄及可见溃疡等特征;其中巨噬细胞是斑块内重要的炎性因素,可刺激多种炎性因子向斑块内趋化、聚集,而且还可促进脂质堆积[10-11];因此,调控斑块内巨噬细胞活性、减少炎症和脂质含量,是稳定AS斑块的有效途径。MOMA-2是单核巨噬细胞的标志物,其表达水平可反映巨噬细胞活性[12]。本研究免疫荧光检测结果显示,三合饮可明显降低AS小鼠主动脉MOMA-2表达,提示三合饮可增加AS小鼠主动脉斑块稳定性,与临床研究结果[5]相符。

NLRP3炎症小体是最具代表性的炎症小体,在外界刺激下,NLRP3与凋亡相关斑点样蛋白结合,促进含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1成熟,进一步切割下游IL-18、IL-1β因子前体,诱导其成熟与分泌,促进AS病变,导致斑块破裂[13-14]。据报道,通过阻滞NLRP3炎症小体,可减轻炎症病变,发挥抗AS的作用[15-16]。本研究结果显示,三合饮各剂量组血清IL-18、IL-1β水平和主动脉根部NLRP3表达明显低于AS组,提示三合饮可调控NLRP3炎症小体,减少下游炎症因子IL-18、IL-1β表达,减轻相关炎症反应。同时,促炎因子IL-18、IL-1β大量表达,也是诱导巨噬细胞迁移、浸润、增殖等过程的重要因子。本研究共定位检测结果显示,巨噬细胞上NLRP3表达经三合饮处理后明显减少,进一步说明三合饮可调节NLRP3表达、减少巨噬细胞,从而稳定AS斑块。

综上所述,疏肝通阳、活血滌痰法冠心病验方三合饮可调控巨噬细胞稳定AS斑块,可能与抑制NLRP3表达有关。中医在稳定AS斑块方面具有整体调节的优势,但中药方中生物活性成分众多,三合饮是否还存在其他的抗AS机制还有待进一步探究。