南北五味子多糖含量及成分比较

武天元

(黑龙江中医药大学·黑龙江 哈尔滨 150040)

五味子为木兰科(Magnoliaceae)植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果实,南五味子为木兰科华中五味子SchisandrasphenantheraRehd. et Wils.的干燥成熟果实[1]。通常根据五味子生长区域不同分为南、北五味子,主要产于东北地区的五味子习惯称为“北五味子”,主产于华东、华中、云贵等地的五味子习惯称为“南五味子”。南、北五味子在历史上曾作为同一味中药材应用,2000年《中国药典》将南、北五味子加以区分应用,除质量标准不同外,性味归经、功能主治等表述均一致。二者作为同属植物基原,性状等方面较为相似,市场上存在掺入、混用等现象[2]。五味子中主要含有木脂素类、多糖类、皂苷类、挥发油类等活性成分[3],现代药理学研究表明,五味子多糖具有抗炎、抗氧化、保肝、免疫调节、抗肿瘤、抗衰老等功效[4]。近年来已有HPLC[5]、LC-MS[6]等一系列方法区分南、北五味子木脂素类等成分差异以及GC-MS方法[7-8]区分南北五味子挥发油类成分。目前关于南北五味子多糖结构差异的报道较少,结构差异尚不明确。

本研究通过对南、北五味子中多糖类成分的提取分离纯化得到五味子总多糖,对其多糖结构进行比较,以期丰富南、北五味子多糖差异研究,更好地指导南、北五味子的区分鉴别。

1 材料

北五味子采集于黑龙江省,华中五味子采集于湖北省,经黑龙江省中医药大学孙慧峰教授鉴定分别为北五味子(Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.)、华中五味子(SchisandrasphenantheraRehd.et Wils.)。

N-1100V-W(WD)旋转蒸发仪:日本EYELA东京理化器械株式会社;Christ LDplus冷冻干燥机:北京思达兴业仪器有限公司;FA2104电子分析天平:上海天平厂;2695高效液相色谱仪:Waters公司;8400S红外光谱仪:日本岛津有限公司;BONA-GM-20膜分离机:山东博纳生物科技集团有限公司。

AB-8大孔树脂:天津市汇达化工有限公司;咔唑、苯酚、牛血清蛋白、考马斯亮蓝、半乳糖醛酸、无水葡萄糖、氢氧化钠、浓硫酸、三氟乙酸、磷酸等均为分析纯。

2 实验方法

2.1 五味子多糖的提取 称取南、北五味子药材各500 g,粉碎,10倍量体积加热回流提取3次,每次提取时间为3 h,浓缩提取液,使用AB-8大孔树脂柱色谱进行分离,得到水洗组分,透析后通过膜分离技术(Mw=3 kDa)分别得到南、北五味子总多糖(SCP),浓缩,冷冻干燥,并计算出其膏率。

2.2 五味子总糖含量测定

2.2.1 标准品溶液的制备 精密称取12.5 g苯酚,充分溶解后,定容至250 mL,得5%苯酚溶液。精密称取20 mg无水葡萄糖,充分溶解后,定容至50 mL,得0.40 g/L的无水葡萄糖标准品溶液,梯度稀释得到0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125 g/L的无水葡萄糖标准品溶液。

2.2.2 标准曲线的绘制 分别加入1 mL不同浓度葡萄糖标准溶液,加入5%苯酚0.2 mL摇匀后加入浓硫酸1.0 mL。摇匀后沸水浴15 min,流水冷却至室温,吸取200 μL于96孔板中,测定490 nm处吸光度值,重复3次。以Glu浓度(mg/L)为横坐标,以吸光度值(A)为纵坐标,绘制标准曲线,计算回归方程。

2.2.3 五味子多糖含量测定 精密称取南、北五味子粗多糖各10 mg,定容于25 mL容量瓶内,超声至完全溶解后,配以0.4 g/L五味子粗多糖溶液,将1 mL吸取于试管内,加1 mL蒸馏水拌匀后,继续提取1 mL后,再加1 mL蒸馏水。以此类推,稀释3组不同浓度的药液,重复上述操作步骤,平行测定3次,取平均值,代入测定出来的葡萄糖含量标准曲线中,计算五味子粗多糖中总糖含量。

2.3 五味子总糖中糖醛酸含量测定

2.3.1 标准品溶液的制备 精密称取450 mg硼砂,加5 mL蒸馏水完全溶解后,加入98%浓硫酸定容至50 mL棕色容量瓶中储存。精密称取0.05 g咔唑,定容至50 mL棕色瓶中储存。精密称取10 mg半乳糖醛酸标准品,蒸馏水定容至25 mL,得0.4 g/L半乳糖醛酸标准溶液,梯度稀释得0.2、0.1、0.05、0.025 g/L半乳糖醛酸标准溶液。

2.3.2 标准曲线的绘制 分别加入0.2 mL不同浓度的半乳糖醛酸标准品溶液。加入1.2 mL的硫酸-硼砂溶液,烘箱中加热5 min,冰水浴降至室温。加入1 g/mL咔唑无水乙醇溶液0.04 mL摇匀,烘箱中加热10 min,待冷却后摇匀,分别吸取200 μL于96孔板上,用酶标仪测定525 nm处吸光度值,重复测定3次。利用以糖醛酸浓度(mg/L)为横坐标,吸光度值(A)为纵坐标,绘制半乳糖醛酸标准曲线,并计算回归方程。

2.3.3 五味子多糖糖醛酸含量测定 精密称取 南、北五味子多糖各10 mg,定容到25 mL容量瓶内,超声至完全溶解后,获得北五味子多糖溶液的浓度0.4 g/L。将1 mL吸取于试管内,加1 mL蒸馏水拌匀后,继续提取1 mL后,再加1 mL蒸馏水。以此类推,稀释3组不同浓度的药液,重复上述操作步骤,平行测定3次,取平均值,代入半乳糖醛酸含量标准曲线,计算五味子多糖中糖醛酸含量。

2.4 五味子多糖总蛋白含量测定

2.4.1 标准品及样品溶液的制备 精密称取考马斯亮蓝G250 25 mg,加入12.5 mL 95%乙醇溶解,再加入85%的磷酸25 mL,蒸馏水定容至250 mL,过滤,得0.1 g/L考马斯亮蓝溶液,避光保存。精密称取25 mg牛血清蛋白,蒸馏定容至250 mL,得0.1 g/L标准蛋白质溶液,梯度稀释得50、25、12.5、6.25 mg/L的标准蛋白溶液。分别精密称取南、北五味子多糖各25 mg,定容至25 mL得1 g/L五味子多糖溶液。

2.4.2 标准曲线的绘制 分别吸取不同浓度标准蛋白溶液0.2 mL于试管中,分别1 mL的考马斯亮蓝溶液,测定595 nm波长处吸光度值。以牛血清白蛋白浓度(μg/mL)作为横坐标,以吸光度(A)作为纵坐标,绘制标准曲线,并计算出相应的回归方程。

2.4.3 五味子多糖总蛋白含量测定 精密称取南、北五味子多糖各25 mg进行,用蒸馏水定容到25 mL容量瓶内,制得1 g/L北五味子多糖溶液,在试管内分别提取0.2 mL溶液,反复以上操作,平行测定3次,取其平均值,代入蛋白质含量标准曲线内,计算南、北五味子多糖蛋白质含量。

2.5 五味子多糖红外光谱分析 称取南、五味子多糖各2 mg,采用KBr压片法,测定五味子的红外波谱图,扫描范围为400～4 000 cm-1。

2.6 五味子多糖单糖成分测定 分别精密称取南、北五味子多糖样品各5 mg,加入2M TFA溶液3 mL,110 ℃反应4 h,旋干,加入甲醇继续旋至无酸味,加水溶解,过0.22 μm滤膜。使用Thermo ICS 6000离子色谱仪,使用Dionex CarboPacTM PA20色谱柱(3×150 mm),流动相A为水,B为100 mM/L氢氧化钠-水溶液,C为100 mM/L醋酸钠-水溶液,混合洗脱。流速0.5 mL/min,柱温25 ℃,进样量体积5 μL。

3 结果

3.1 五味子多糖含量测定结果 北五味子多糖提取率为10.6%,南五味子多糖提取率为5.56%。采用苯酚-硫酸法测得的葡萄糖含量标准曲线为y=0.0046x + 0.033(R2=0.9997),见图1,计算得北五味子多糖总糖含量67.07%,南五味子多糖总糖含量5.56%。

图1 葡萄糖标准曲线

采用硫酸-咔唑法测得的半乳糖醛酸标准曲线为y=0.0052x+0.0905(R2=0.9905),见图2,计算得北五味子多糖中糖醛酸含量为22.05%,南五味子多糖中糖醛酸含量为29.1%。

图2 半乳糖醛酸标准曲线

使用考马斯亮蓝法获得的标准曲线为y=0.003x-0.0132,(R2=0.9996),见图3。计算得北五味子多糖中所含蛋白质含量为0.7%,南五味子多糖中所含蛋白质含量为1.7%。

3.2 五味子多糖红外光谱分析 北五味子的FT-IR光谱在3 307、2 918、1 100 cm-1处显示出多糖的特征吸收峰,见图4;此外,在1 739、1 629 cm-1处的吸收峰表示北五味子含有酸性多糖。南五味子在3 378、2 919、1 101 cm-1处显示出多糖的特征峰,见图5;此外,在1 728、1 612 cm-1处的吸收峰表示南五味子含有酸性多糖。

图4 北五味子多糖红外光谱

图5 南五味子总多糖红外光谱

A.北五味子单糖组成;B.南五味子单糖组成(1.鼠李糖;2.阿拉伯糖;3.半乳糖;4.葡萄糖;5.木糖;6.甘露糖;7.半乳糖醛酸)图6 南、北五味子多糖离子色谱图

3.3 五味子多糖单糖成分测定结果 北五味子多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、半乳糖醛酸、甘露糖组成;其摩尔百分比分别为0.1%、0.63%、9.8%、43%、0.37%、33%、13.5%,其中含有33%的酸性糖和67%的中性糖。南五味子多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、甘露糖组成;其摩尔百分比分别为10%、0.48%、1.8%、18.4%、64.5%、4.7%其中含有64.5%的酸性糖和35.5%的中性糖。

4 讨论

《本草纲目》中记载:“五味,今有南北之分,南产者,色红;北产者,色黑,入滋补药必用北产者乃良”[9],《本草求真》中记载:“北产紫黑者良。”[10],《本草蒙筌》中记载,“南北各有所长,藏留切勿相混,风寒咳嗽南五味为奇,虚损劳伤北五味最妙”[11]。其中所含活性成分种类含量的差异,可能是导致功效差异的关键。本研究表明,南北五味子总多糖中总糖含量北五味子高于南五味子,而糖醛酸含量南五味子高于北五味子。单糖组成分析结果表明南北五味子单糖组成比例具有一定的差异。北五味子中含有较多的中性糖,以葡萄糖含量最多,南五味子中含有大量的酸性糖,主要为半乳糖醛酸[12]。可根据化学成分的差异指导南、北五味子的临床使用。