从自噬角度探讨肾虚痰浊型绝经后骨质疏松症的发病

薛瑶珺,周广文,朱 伟,熊梦欣,谭张奎,黄诗怡,向 楠

(1. 湖北中医药大学,湖北 武汉 430061;2. 武汉大学公共卫生学院,湖北 武汉 430061)

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是一种常见于中老年妇女群体,以骨量低、骨微结构退化、骨脆性及骨折易感性增高为特征的一种全身代谢性疾病[1]。中医认为肾精亏虚是PMOP发病的基础。本团队提出,PMOP还与“痰浊”的发生密切相关,是以辨证为“肾虚痰浊”。流行病学调查分析示绝经后妇女普遍存在骨丢失以及血脂紊乱现象[2],现代医学广泛认识到,女性绝经后的卵巢功能下降是导致雌激素缺乏的重要因素,从而引起骨、脂代谢的微观水平失调,而膳食、生活习惯等因素更是加重了这种情况[3]。这与团队前期提出的肾虚痰浊也是PMOP的重要病机不谋而合:肾精、肾气充足是人体生长发育的基础,是维护各脏腑正常生理功能和机体生命活动的根本。当妇女因增龄出现肾精衰少、肾气亏损,机体阴阳状态失衡、脏腑代谢失调,久之则生痰浊流滞于体内,导致各种紊乱状态。这一过程与细胞自噬功能颇为相似:自噬是机体一种高度调控的过程,当受到外界刺激时可被诱导出来,以清除细胞内的受损或过多的细胞器和细胞成分,从而保持细胞的自身稳态;若自噬功能受损则细胞无法自我修复,机体产生的多余或有害物质停留体内,进一步加重机体代谢失衡状态[4]。笔者从自噬角度探讨了肾虚痰浊型PMOP的发病情况。

1 PMOP“肾虚痰浊”的古籍源流

1.1肾亏为发病之本 PMOP属中医“骨痿”“骨痹”等范畴。肾藏精气,主司人体生长发育,是谓先天之本。形体发育有赖于骨骼的发育,而精生髓存于骨中以滋骨,肾之精不足,则髓化生无源,导致骨骼脆弱,则发病为骨痿。如《素问·痿论》云:“肾主身之骨髓。”《黄帝内经·素问》云:“骨枯而髓减,发为骨痿。”肾精随着机体发育不断充盈则“天癸至”;而后又随着增龄过程而逐渐衰减则“天癸竭”。如《素问·上古天真论》云:“女子……二七而天癸至,任脉通,太冲脉盛,月事以时下……七七,任脉虚,太冲脉衰少,天癸竭。”女子七七肾气衰减,气不化精,精不生髓则无以养骨。因此,中医认为PMOP的发生以肾虚为本,应从肾而论。

1.2痰浊为发病之标 “痰”首载于《内经》中,被称为“积饮”“水饮”,《金匮要略》《伤寒论》均有记载“痰饮”致病及理法方药。肾主水,其生理功能之一是调节人体的水液代谢,如《素问·逆调论》曰:“肾者水脏,主津液”。若肾气亏,阳不足无以蒸化水液,停而化生痰饮。痰在骨中,则“行动艰难,遍身疼痛者,痰入骨也。”(《丹溪心法》)故有“肾为生痰之源”(《时方歌括》)之说。痰浊犯肾,多表现为腰背强痛、关节疼痛、耳鸣耳聋、尿频遗精等,如李梴于《医学入门》中描述“痰聚于肾,多足膝酸软,腰背强痛,肢节冷痹骨痛,名曰寒痰,又名虚痰”“痰在腰肾,腰间骨节卒痛”等;又如张锡纯《医学衷中参西录》云:“肾主闭藏, 以膀胱为腑也。其闭藏之力,有时不固,比注其气与膀胱。膀胱膨胀,不能空虚若谷,既不能吸引胃中水饮,速于下行而为小便,此痰之由来也。”肾痰之证,常见阴虚水沸、阳虚水泛,故治当滋阴降痰、温阳摄痰[5]。

此外,脾主运化,输送水谷精微至全身以荣各部组织,为后天之本。脾气虚,运化失职,亦能化生痰邪。“胃为水谷之海……精化则髓充,髓充则足能履也”(《儒门事亲》),可见脾与骨亦密切相关。《脾胃论》曰:“大抵脾胃虚弱……脾胃则下流乘肾……则骨乏无力,是为骨痿。”因此,肾、脾二脏虚弱,化生“痰浊”有源,为骨/脂代谢紊乱的病理因素。因此,本团队认为PMOP的中医病因病机以肾虚为本,以痰浊为加重因素,影响骨骼-机体的骨/脂代谢平衡,进一步加重PMOP。这与现代医学所提出的以雌激素下降为主,后天饮食和生活习惯为加重因素相吻合。基于此,本团队提出“痰浊”是PMOP的加重因素之一。

2 肾虚痰浊在PMOP发病中的现代医学内涵

2.1肾虚痰浊是骨髓间充质干细胞分化紊乱的微观学机制 现代医学普遍认同成骨细胞(osteoblasts,OB)和破骨细胞(osteoclasts,OC)介导的骨重建失衡是骨质疏松发生的基础发病机制[6]。此外,科学界也提出骨髓内/外的脂质代谢紊乱亦可能是PMOP发病的重要因素:骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向成骨和成脂方向分化对骨骼重建有直接或间接的影响[7],绝经后妇女卵巢衰退所致雌激素水平降低与髓外的机体脂代谢紊乱亦紧密相关。

BMSCs的分化过程中有多个信号通路的调控以及转录因子的参与:早期前成脂细胞的转录因子过氧化物酶体增殖剂激活受体 (peroxisome proliferators-activated receptors,PPARs)可以促进BMSCs的定向成脂分化,而由于BMSCs骨、脂分化间的竞争性转化作用,OB分化则相对减少,这是导致骨质疏松/PMOP的重要机制[7]。中医的“肾主骨生髓”理论,是谓肾气充而化精,精以生髓,则骨骼百骸得以濡养,其内涵与现代医学中BMSCs向成骨分化较为相似[8]。众多研究表明,以补肾生髓法实现的骨类疾病干预治疗均是以靶向BMSCs及其微环境为基础的[9-11]。

骨髓腔中不仅存在骨代谢失衡,也存在脂代谢紊乱,骨髓脂肪组织(bone marrow adipose tissue,BMAT)堆积、骨髓微循环灌注障碍在PMOP的骨髓微环境变化中发挥重要作用,骨量减少常与BMAT增多共存[7,12]。如《说文解字》中的描述“髓者,骨中脂也”。而“痰入骨中”所致骨痿、骨痹在现代医学中可有以下两方面的含义:其一,BMAT分泌的多种细胞因子、生长因子及脂肪因子可促进成脂分化,使邻近的骨细胞的生长受到负面影响,OB的数量减少,进而刺激OC生成,导致骨重建失衡[13]。另一方面,BMAT的增多可挤压骨小梁,压迫其间微血管从而减少血流灌注,导致骨髓营养及氧的缺失,降低骨矿物质沉积,进而刺激破骨细胞OC的活性[14],从而破坏骨代谢紊乱发病。研究发现,补肾益髓方可靶向调节BMSCs功能,恢复其异常分化状态,从而有效缓解实验小鼠的骨质流失和脂肪沉积[15],也进一步证实了肾虚、痰浊与BMSCs分化失衡之间的密切联系。

2.2痰浊是髓内/外脂代谢紊乱的病理产物 如前文所述,“痰浊”可能是PMOP发生的重要因素之一,作为病理产物可与脂代谢紊乱互相影响。现代研究表明,“痰浊”体质内可能会出现脂质代谢改变,进而引起或加重疾病的发生[16]。其中,PMOP的发生还可能与髓外脂质代谢状态相关,如血脂水平、肝脏脂质水平、体成分及体重等因素,进而与骨重建过程建立联系。

2.2.1血脂水平 脂代谢紊乱综合征主要表现为血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)增高,高密度脂蛋白(HDL-C)降低以及低密度脂蛋白(LDL-C)升高[17]。与其他证型相比较,痰浊阻遏型的血清样本中能检测到更高的TG脂蛋白残粒含量,提示了现代医学所说的TG水平可能与中医学“痰浊”概念相关[18]。此外,亦有研究证实:高血脂与骨质流失的发生率在绝经后明显增加且往往同时存在[3];骨、脂代谢在遗传基因上也具有一定程度的相关性[19];围绝经期抗骨质疏松药物可以调节血脂,降脂药物同样对围绝经期骨质流失具有改善作用[2]。

2.2.2肝脏脂质水平 肝脏是机体脂质代谢的重要器官,TG在肝脏合成后储存于脂滴中,随后在多种脂肪酶的参与下水解[20]。当体内的脂质含量超过了机体正常所需时,过剩的脂肪会在肝脏沉积,从而导致肝功能受损[21]。中医认为肝失疏泻,痰浊停留于肝是非酒精性脂肪肝(NAFLD)的关键所在,而肾气之盛衰为其根本,若肾阳气化不足,则加重痰浊湿滞[22]。研究表明,NAFLD与骨质疏松症显著相关:NAFLD患者与骨质疏松患者的骨密度无明显差异,且与既往骨质疏松病史显著相关[23];二者均有胰岛素抵抗、慢性炎症、生活习惯和缺乏维生素D等共同致病因素;治疗上,绝经后妇女采用的雌激素替代疗法也被发现有益于肝脏及骨骼[24]。

2.2.3体成分及体重 脂肪组织99%都由白色脂肪(white adipocytes tissue,WAT)构成,其功能为储存能量和释放脂肪酸,一旦脂肪累积超出细胞的储存能力,就会在肝脏、肌肉和骨骼中出现异位脂肪储存现象[25],也因此引起肥胖等相关疾病。《丹溪治法心要》中对“肥白人多痰湿”曾进行明确描述,认为“痰”即为肥胖的病机。鞠大宏等[26]实验表明,在建立去卵巢骨质疏松大鼠模型后,动物体型明显肥胖,镜下观察到较多的脂肪细胞和退化的骨微结构等,说明了PMOP模型可存在脂代谢异常。这与本文认为“痰浊”是PMOP的重要致病因素也相符。

Tchernof等[27]表示雌激素水平能够影响WAT:啮齿动物在摘除卵巢后WAT会增加,但用雌激素治疗后则会减少。同样的,妇女绝经后的WAT含量也有一定的提高,但在雌激素疗法后会有所降低。体重95%由肌肉与脂肪组成,健康的脂肪组织可通过合成雌激素、分泌脂肪因子调节骨代谢过程,以维持骨量;此外,由于脂肪对人体的承重作用,较高的体重可在一定程度上避免骨质疏松及脆性骨折[28]。然而绝经前后女性的体重增长通常是肌肉组织含量的减少和脂肪组织的过量堆积所致,该情况下的体重数即使较高或无明显改变,但由于脂肪比例较高,也引起了骨骼中的脂肪堆积,一定程度上妨碍了正常的骨代谢。因此,脂肪及骨骼肌的水平变化是影响骨代谢的重要因素,脂肪含量的非正常变化可能是引起PMOP脆性骨折发生的原因之一。

3 自噬介导骨/脂代谢影响PMOP发病

自噬是一种细胞特有的自我保护机制,它依赖于溶酶体途径来实现自身成分的降解,是一种细胞“自我消化”的代谢过程[29]。作为机体的高度调控过程,自噬在受到外界刺激时可被诱导出来以清除细胞内损伤或多余的细胞器及胞成分,维持细胞自稳态[4,30]。此时大量游离的膜结构(即自噬前体)脱落于胞浆中形成双层膜结构[31],随后在自噬相关基因(Autophagy associatd gene,Atg)蛋白的协助下形成自噬溶酶体,降解内膜及内含物使其被再次循环利用[32-33]。

3.1自噬活性降低诱发骨代谢失衡 研究发现自噬对BMSCs抗肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)诱导的细胞凋亡有保护作用,增强BMSCs的自噬能力可以提高细胞在炎症环境中的存活[32];而多项研究表明,PMOP存在微炎症状态的持续激活[34],这与课题组的前期研究一致,即与假手术组相比,PMOP模型大鼠骨组织白细胞介素6(IL-6)、TNF-α的表达显著增加,呈现微炎症状态[35]。因此,雌激素缺乏引发的自噬降低及微炎症状态下,BMSCs活性亦有所降低。且自噬水平的变化调控着BMSCs的定向分化。细胞培养证实雌激素缺乏时,抑制LC3、Beclin1表达,使得骨组织的BMSCs自噬活性下降,骨生成减少;自噬可通过AMPK/Akt/mTOR信号通路调节BMSCs向成骨细胞分化[36],亦能通过促进雷帕霉素以阻断mTOR信号转导,从而抑制BMSCs向脂肪细胞分化[37]。Qi等[38]通过敲低Atg5和Beclin1在小鼠骨细胞中的表达,发现BMSCs的自噬水平显著降低,成骨分化显著减少,但脂滴生成明显增多。这也证实了提高BMSCs自噬水平能促进成骨细胞的分化,并抑制成脂细胞的分化[39-40]。 可见,自噬活性降低,BMSCs活性降低,且成骨分化能力减弱,骨形成减少,且同时可伴有成脂分化能力增强。

3.2自噬活性降低,脂代谢紊乱 BMAT的生成受到AMPK/mTOR/ULK1信号通路介导的自噬的影响。随着自噬活性降低,BMAT数量急剧增加,占据了骨髓空间,从而导致骨小梁的数量、体积相应减少;同时,BMAT对骨小梁间微血管造成了压迫,造成了血流循环不足、骨营养不良现象。此时会减少骨矿物质的沉积,并激发OC的活性[39]。因此,自噬活性下降,BMAT增多,骨量减少,OC活性增强,促进PMOP的发生和发展。

细胞线粒体在脂解过程中产生TG,而TG在氧化过程中可以释放游离脂肪酸(free fatty acids,FFA)[40],而FFA可被肝细胞吸收并转换成TG与TC一同储存在LD中,随后LD中的TG又被水解产生FFA,经酯化后再次存储于TG中,当TG表达上调。TC和TG可被自噬体吸收并转移到溶酶体降解,此时FFA和细胞内的脂质储存水平受到影响,又可继续影响TC和TG水平[41]。可见,充分诱导自噬促进脂质合成与分解。而自噬功能缺乏则导致机体脂代谢紊乱,可表现为血脂异常升高、内脏脂肪堆积等,进一步表现为骨骼内脂质异常沉积,影响骨微结构。实验研究表明,若抑制肝细胞自噬表达,则血脂水平明显升高[42]。Singh等[41]特异性地敲除小鼠Atg7后发现血清TG含量显著上升。该实验还发现,高脂饮食可显著降低小鼠肝脏的自噬水平。

自噬参与机体脂肪组织的合成与分解[43],对脂肪有着双向调节作用:一方面,脂肪细胞通过激活自噬和线粒体自噬促进自身的溶解[44];另一方面,自噬能够促进脂质的合成,维持脂质代谢的相对稳定,而线粒体的自噬则可抑制白色脂肪棕色化[41,45]。自噬功能减弱,对脂肪细胞代谢调节降低,脂代谢失衡,导致异位(如内脏、骨骼)脂肪沉积现象。研究表明内脏脂肪组织定量结果可与骨密度(BMD)以及骨骼质量负相关[7]。因此,自噬活性降低,异位脂肪堆积过多,机体的脂代谢过程紊乱,对骨代谢的协同保护作用减弱,加重PMOP的发展。

4 自噬是影响PMOP“肾虚痰浊”发病的微观机制之一

中医认为,自噬的病理生理机制与中医气虚、痰浊血瘀的病机联系密切。自噬是气化功能的微观体现,是基于机体的致病正邪性质做出相应调节与平衡的方式:如自噬过度活跃使代谢降解过度,则与机体阳盛或阴偏衰所致的代谢偏亢一致。自噬水平不足使得代谢低下产物堆积,则与机体阳偏衰或阴盛所致的代谢偏衰一致。自噬的过度活跃与不足均可引起病变[46]。气化过程中的升降失常以及阴化和阳化的太过或不及亦可导致“肾虚”“痰浊”的病理状态,加重骨/脂代谢环境紊乱,影响自噬功能的充分诱导。此外,现代与传统医学达成一致,即“痰浊”是自噬失活导致的代谢功能不足,病理产物在体内堆积的结果[47]:肾脏的气化功能随增龄而衰退,机体及五脏六腑功能不足,细胞自噬功能下降,则脂质代谢过程中损坏、衰老的细胞器和发生错误的蛋白质等代谢产物在体内堆积,等同于中医的“痰浊内生”[48]。脂质在骨骼和机体中过度堆积,加速体内骨、脂代谢紊乱,影响骨骼微环境,最终造成了PMOP肾虚痰浊的病机。

根据中医学阴阳及气化理论,中医药能够纠正这种太过或不及,平衡阴阳状态,即抑制或促进自噬水平,从而达到防治疾病的目的。维持一定的自噬水平能通过溶酶体途径保证“痰邪”等物质能被及时清除。补肾化痰的中药对自噬有一定作用:补肾通络方可通过降低自噬相关基因的表达来抑制OC的分化,对斑马鱼骨质疏松症模型起到明显改善作用[49];远志提取物能抑制mTOR和p70s6k活化以增强自噬,促进多余代谢产物的清除[50],但目前仅证实了这种作用与改善阿尔兹海默症有关。综上所述,笔者认为改善自噬活性调控骨/脂代谢是中医药防治PMOP以及纠正“肾虚痰浊”状态的新方法,且这种方法可能与化痰作用有关。见图1。

图1 自噬的中医内涵及与PMOP肾虚痰浊病机的关系

5 治疗与展望

现代医学治疗PMOP多以激素替代疗法、抗骨吸收和促骨形成的西药为主,但尚无理想的治疗方案。中医普遍认为PMOP本病在“肾虚”,但其辨证分型尚未统一,临床治疗多以“补肾益肝”为主[51]。由此可见,目前中西医治疗均未找到理想的干预措施,研究该病确切的发病机制及相关因素至关重要。

基于PMOP的临床特点、骨/脂代谢失衡与痰浊之间的关系,课题组认为肾虚痰浊可致PMOP,治疗在补肾的原则上还应从“痰”论治[52]。因此,导师向楠教授结合《本草纲目》补骨脂丸与《丹溪心法》黄瓜蒌丸,自拟补肾化痰方作为临床治疗肾虚痰浊型PMOP的基本方药。本团队前期证明了补肾化痰方具有调控成骨/成脂分化、改善骨重建失衡以及调节脂代谢紊乱的作用[52-54],但此类作用是否能通过调控自噬来实现需要进一步的实验研究。此外,目前较少有基础研究证实化痰类中药可以通过影响自噬来干预PMOP,故课题团队以自噬为靶点开展理论和基础研究,旨在为补肾化痰方干预髓内/外脂代谢治疗PMOP提供确切依据。

综上,女性绝经期雌激素水平降低引起骨骼重建失衡和髓内/外脂质代谢紊乱,而后天饮食及生活习惯成为加重因素,骨、脂代谢失调互为影响,从而导致或者加剧PMOP发病。这种骨/脂代谢异常可能是“肾虚痰浊”在现代医学PMOP发病内涵中的体现。雌激素水平下降导致的自噬功能受损可能是PMOP发生的重要微观机制,它可以调控相关信号通路,从而加剧骨质流失和脂质代谢紊乱,进一步加速病情发展。以自噬为靶向性调节是否能有效缓解肾虚痰浊的机体状态,以达到改善或治疗PMOP的目的,是本团队的关注重点之一,其研究结果将为中医药治疗PMOP提供新的理论依据和思路方法。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。