决明子水提物对急性酒精性肝损伤小鼠的保护作用研究

闫志芳，任可乐，孟祥龙，李秀英

（山西中医药大学 中药与食品工程学院，中药炮制山西省重点实验室，山西 晋中 030619）

酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是肝脏相关疾病和肝病死亡的主要原因之一[1]。ALD早期表现为急性酒精性损伤，主要原因是短时间内饮用的大量酒精。肝细胞在人体消化吸收代谢酒精时，产生大量的氧自由基和多种炎性介质，这些物质使肝脏的氧化还原反应无法进行，导致脂质过氧化，损害细胞膜，细胞器的功能受到限制，肝脏受到损伤[2]。现代医学治疗ALD需长期服用的保肝药物会产生一定的耐药性、药源性疾病等不良反应。

决明子为豆科植物钝叶决明Cassia btusifoliaL.或决明（小决明）Cassia toraL.的干燥成熟种子，具有清热明目，润肠通便的作用。研究发现，决明子富含多种化学活性物质，主要包括蒽醌类、脂肪酸类、黄酮类、多糖类、苷类等[3]，具有保肝[4]、降血压[5]、降脂[6]、降糖[7]、抗氧化[8]等药理作用。其中，水溶性物质蒽醌类等被证实通过改善转氨酶水平、抗炎、调节Nrf2介导的ERK/MAPK/JNK等信号通路等，缓解酒精引起的急性肝损伤[9-13]。

为研究决明子缓解酒精所致肝损伤，本文通过灌胃白酒建立小鼠急性酒精性肝损伤模型[14]，经决明子水提物给药后检测小鼠血清及肝脏组织中生化指标与血清炎性因子的变化，观察肝脏病理组织病变程度，以明确决明子水提物对于肝脏的保护作用，并探讨初步的作用机制，旨在为决明子进一步开发与利用提供实验基础与理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

决明子（北京同仁堂，产地安徽，批号：220216004），经山西中医药大学张朔生教授鉴定为豆科植物钝叶决明Cassia obtusifoliaL.或决明（小决明）Cassia toraL.的干燥成熟种子。白酒（42°，北京红星）；水飞蓟素（批号：C10742879，麦克林）；通用型组织固定液（批号：G1101，Servicebio）；油红染液、苏木素染液、分化液、返蓝液、甘油明胶封片剂（Servicebio）；异丙醇（批号：80109218，国药集团）。

甘油三酯（TG，批号：20210819）、总胆固醇（TC，批号：20210530）、丙氨酸氨基转移酶（ALT，批号：20200815）、天冬氨酸氨基转移酶（AST，批号：20210726）、丙二醛（MDA，批号：20200921）、谷胱甘肽（GSH，批号：20209717）（南京建成生物工程研究所）；肿瘤坏死因子（TNF-α，批号：202109），白介素1β（IL-1β，批号：202107）、白介素6（IL-6，批号：202106）（上海酶免生物）；实验用水均为超纯水。

1.2 仪器与设备

TGL-20B高速冷冻离心机（中国上海安亭科学仪器厂）；AX224ZH/E十万分之一电子天平（奥豪斯上海）；KZ-III-FP高速低温组织研磨仪（武汉赛维尔）；SynergyHTX多功能酶标仪（美国伯腾）；RE-2000B旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；CRYOSTAR NX50冰冻切片机（Thermo）；LEICA 819切片刀（ 上海徕卡）；黏附载玻片（冰冻切片，白漆色带，G6012-2，Servicebio）。

1.3 实验动物

SPF级ICR小鼠，雄性，体重15～25 g，许可证号：SCXK（京）2019-0011，合格证号：110324210102969025[斯贝福（北京）]。伦理批准号：AWE202209002（动物实验经山西中医药大学医学伦理委员会批准）。实验期间动物饲养于温度25 ℃，湿度40 %～70 %的清洁级动物房。

1.4 方法

1.4.1 决明子水提物的制备 称取决明子200 g，加8倍量的水，浸泡1 h，再加热回流提取2次，每次30 min，将提取液混合浓缩至200 ml（相当于生药1 g/ml），备用。

1.4.2 动物分组、造模及给药 参照文献方法[15]，将60只小鼠适应性饲养一周，按体质量高低，随机分为空白组、模型组、阳性组、决明子水提物低、中、高剂量组（2.25，4.5，9 g/kg）（依据2020年版《中国药典》，通过人临床剂量换算成小鼠等效剂量，按照折合后剂量的3，9，18倍换算而得），每组10只。空白组与模型组灌胃等体积蒸馏水，阳性组灌胃水飞蓟素（0.2 g/kg），其余各给药组按照相应剂量灌胃给药，连续给药7 d。末次给药9 h后，除空白组外其余各组均按照体质量12 ml/kg一次性灌胃白酒（10 ml/kg），建立急性酒精性肝损伤模型。

1.4.3 血液和组织样本采集 最后一次给药结束后，乙醚麻醉，摘眼球取血，室温静置30 min，于3000 r/min离心15 min，得待测血清，放置于-80 ℃冰箱。分离取肝脏并称重，部分肝脏固定于组织固定液中，其余肝脏置于-80 ℃冰箱。

1.4.4 体重变化及脏器指数 记录60只小鼠体质量每日的变化，计算小鼠日平均增重；解剖取新鲜肝脏，利用生理盐水清洗干净肝脏，置于滤纸上吸干水分后，称重，计算肝脏的脏器指数。计算按式1、式2。

1.4.5 肝脏组织油红O染色 取肝脏组织同一部位的组织做冰冻切片，经生理盐水清洗后，用4 %多聚甲醛溶液固定，冰冻切片，晾干，油红染液浸染6～8 min。将切片停留3 s后依次浸入60 %异丙醇分化2次，各3 s和5 s，再依次浸入纯水中浸洗2次，各10 s。取出切片，停留3 s后浸入苏木素复染3～5 min，纯水浸洗3次，各5，10，30 s。分化液（以 60 %酒精为溶剂）分化2～8 s，蒸馏水洗2次各10 s，返蓝液返蓝1 s，将切片轻轻浸入自来水中浸洗2次，各5 s和10 s，甘油明胶封片。在显微镜下观察肝脏组织的形态学，并采集图片[10]。

1.4.6 生化指标检测 参照试剂盒说明，检测小鼠血清中TG、TC、ALT、AST、MDA含量以及肝脏组织中GSH的含量。

1.4.7 炎性因子水平的测定 采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平。

1.4.8 统计学方法 用GraphPadPrism 8.0.2统计软件进行t检验，以均数±方差（±s）表示为数据资料，组间比较以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 对急性酒精性肝损伤小鼠体重及肝脏指数的影响

与空白组相比，模型组体质量显著降低，肝脏指数显著升高（P＜0.05或P＜0.01）。体重降低表明酒精性肝损伤可能引起某些病理变化，引起小鼠食欲下降致体重增长减慢；肝脏指数显著升高说明一次性大量饮酒使得肝脏受损，导致肝脏肿大。与模型组比较，阳性药和决明子水提物高剂量组小鼠体质量增长明显，且能显著降低肝脏指数（P＜0.05或P＜0.01），结果呈剂量依赖关系。表明决明子水提物可降低小鼠的肝脏指数，缓解酒精造成的肝脏肿胀问题（见图1）。

图1 决明子水提物对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏指数、小鼠体质量的影响（±s，n=10）

2.2 对急性酒精性肝损伤的小鼠肝脏病理影响

肝脏组织油红O染色结果见图2。由图2可见，空白组小鼠肝组织未见脂肪颗粒堆积。模型组与空白组对比肝细胞体积增大，出现大量的不同程度的红色脂滴聚集。与模型组相比，决明子水提物各组的脂滴聚集减少。结果表明，决明子水提物能减少急性酒精性肝损伤的小鼠体内脂质的累积。

图2 决明子水提物对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏的病理变化的影响（×200）

2.3 对急性酒精性肝损伤小鼠血清TG、TC含量的影响

与空白组相比，模型组小鼠TG、TC水平显著升高（P＜0.05或P＜0.01）。与模型组相比，决明子水提物各剂量组TG、TC含量均有下降趋势，阳性药组与决明子水提物中、高剂量组TG、TC含量呈显著下降（P＜0.05或P＜0.01）（见图3）。表明决明子水提物能有效降低急性酒精性肝损伤血清中的TC、TG水平，对急性酒精性肝损伤有一定的改善作用。

图3 决明子水提物对急性酒精性肝损伤小鼠TG、TC含量的影响（±s，n=10）

2.4 对急性酒精性肝损伤小鼠血清氨基转移酶水平ALT、AST含量的影响

与空白组相比，模型组小鼠ALT、AST两种氨基转移酶水平显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，阳性药组与决明子水提物各剂量组ALT含量均明显下降（P＜0.01），且呈剂量依赖性；阳性药组与决明子水提物中、高剂量组AST含量均明显下降（P＜0.01）（见图4）。结果表明，决明子水提物能显著降低氨基酸转移酶的水平。

图4 决明子水提物对急性酒精性肝损伤小鼠AST、ALT含量的影响（±s，n=10）

2.5 对急性酒精肝损伤小鼠血清GSH含量的影响

与空白组相比，模型组小鼠GSH含量显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，阳性药组与决明子水提物中、高剂量组GSH含量显著升高（P＜0.05或P＜0.01）（见图5）。结果表明，决明子水提物可提高机体抗氧化酶的活性，消除酒精代谢过程中产生过多自由基及其他损害物质，从而减轻肝脏受损状况。

图5 决明子水提物对急性酒精性肝损伤小鼠GSH含量的影响（±s，n=10）

2.6 对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏MDA含量的影响

与空白组相比，模型组小鼠MDA水平显著升高（P＜0.001）；与模型组相比，各剂量组均有不同程度的降低趋势，阳性药组与决明子水提物高剂量组MDA水平显著降低（P＜0.05或P＜0.01）（见图6）。结果表明，决明子水提物可减缓代谢酒精过程中脂质过氧化反应，对急性酒精性肝损伤有一定的保护作用。

图6 决明子水提物对急性酒精性肝损伤小鼠MDA含量的影响（±s，n=10）

2.7 对急性酒精性肝损伤小鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平的影响

与空白组相比，模型组显著高于正常组（P＜0.01），表明酒精代谢过程中可导致小鼠肝细胞发生炎性损伤；与模型组相比，阳性药组与决明子水提物高剂量组小鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平显著降低（P＜0.05或P＜0.01）（见图7）。结果表明，决明子水提物可抑制炎性因子水平，发挥其肝保护作用。

综上，决明子水提物对酒精引起的酒精性肝损伤有一定的保护作用，其作用机制可能与改善肝细胞代谢紊乱、降低脂质代谢、提高机体抗氧化酶活性、抑制促炎细胞因子表达有关[16-26]。本研究为进一步开发决明子水提物保肝等功能性产品提供理论基础，下一步将探究决明子缓解急性酒精性肝损伤的通路和靶点。