肉源大肠杆菌与假单胞菌混合生物被膜形成分析

季君珂，宓晓雨，袁杨洋，程 宇，张文栋，张 晨，江 芸

（南京师范大学食品与制药工程学院，江苏 南京 210023）

生物被膜是一种微生物在不利环境条件下的生存机制和适应形式[1]。在食品加工环境中，腐败菌和致病菌都可能污染食物，并常以多菌种生物被膜的形式存在[2]。微生物、接触表面、存活环境三者之间发生各种相互作用，对生物被膜的结构与活性产生复杂影响[3-4]。

大肠杆菌（Escherichia coli）是评价食品污染常用指示菌之一，食品中大肠菌群含量表示食品被粪便污染的程度，一些血清型菌株携带毒力基因而具致病性[5-6]。在生猪屠宰、胴体分割、贮运销售过程中极易导致肉类食品污染大肠杆菌。假单胞菌（Pseudomonas）是肉品贮藏末期典型的优势腐败菌，具有很强的分解蛋白质产生腐败产物的能力[7]。研究表明，大肠杆菌和假单胞菌均可在肉品生产加工接触表面以及肉品表面形成生物被膜，且假单胞菌已成为近年来生鲜肉研究中生物被膜的模型细菌[8]。生物被膜附着在接触表面，使菌株细胞对外界不良环境的抵抗力增强，不易清除，成为细菌交叉污染源头和传播中心，对食品安全构成重大威胁。据报道，生物被膜中的细菌与浮游细菌相比，抗性增加10～1000 倍[9]。生物被膜还会增加人类患食源性疾病的风险，据估计80%的细菌性感染与生物被膜有关[10-11]。而多菌种混合被膜在食品生产环境中的存在更为广泛，且近年研究发现混合生物被膜比单种生物被膜对抑菌剂、抗生素等表现出更强的抗性[12-14]，这将对肉品造成反复持久的交叉污染[14-16]，进一步加大安全风险。此外，大量研究表明生物被膜的形成具有显著的菌株差异，研究肉源分离株混合生物被膜的形成对于肉品生产过程中微生物的污染控制更具实际指导意义[17-19]。

本实验结合生产加工实际情况，以肉源大肠杆菌和肉源假单胞菌为研究对象，首先分析两种菌不同菌株生物被膜形成能力；然后采用不锈钢片计数法探讨两种菌不同菌株混合被膜形成过程中被膜量动态变化，进而研究两种菌混合成膜时胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）组成和微观结构的变化；采用实时聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction，realtime PCR）绝对定量方法分析生物被膜和浮游菌中相关成膜基因表达差异及接触表面基因表达绝对量的变化；旨在为揭示肉源腐败微生物混合被膜形成规律提供科学基础，以及为肉类生产加工中微生物风险评估及污染控制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验用大肠杆菌共31 株，为本实验室前期从某生猪屠宰车间（传送带表面、操作台表面，以及车间刀具、手套表面）及猪酮体表面中分离所得[20]。假单胞菌共13 株，为本实验室前期从腐败猪肉中分离所得[21]。

食品级304不锈钢片（75 mm×25 mm×1 mm，2B光洁面）南通顺丰医疗器械有限公司；96 孔透明细胞培养板 美国Corning公司。

胰蛋白胨大豆琼脂（tryptone soya agar，TSA）、胰蛋白胨大豆肉汤（tryptic soy broth，TSB）、酵母提取物（yeast extract，YE）、假单胞菌CFC选择性培养基基础、CFC基础添加剂 北京陆桥技术有限公司；结晶紫、乙醇、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）、丙酮（均为分析纯）南京藤春生物科技有限公司；苯酚（分析纯）南京峰昌生物科技有限公司；浓硫酸（分析纯）南京化学试剂有限公司；BCA蛋白浓度检测试剂盒 南京建成生物科技有限公司；总RNA提取试剂盒（D9108A）、PrimeSTAR®Max DNA聚合酶、Prime Script™ RT Master Mix反转录试剂盒、TB Green Premix ExTaq(Tli RNaseH Plus)荧光定量试剂盒日本Takara公司；DNA Marker（DL 2000）、Gel Red核酸染料 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 仪器与设备

M2多功能酶标仪、Thermal Cycler普通PCR仪美国Molecular Devices公司；2-16KL高速冷冻离心机美国Sigma公司；Nano-30微量紫外分光光度计 杭州奥盛仪器有限公司；SW-CJ-2F超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；HVE-50立式压力蒸汽灭菌锅 日本Hirayama公司；HX-4拍打式无菌均质器 上海泸析实业有限公司；QL-200微型涡旋混合仪 海门其林贝尔仪器有限公司；ZQTY-70台式振荡培养箱 上海知楚仪器有限公司；DHP-9052电热恒温培养箱 上海一恒科技有限公司；LSM 710共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscope，CLSM）德国Carl Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1 菌液制备

将冻存的大肠杆菌和假单胞菌分别在TSA-YE平板上划线活化两次，分别在37 ℃培养24 h和28 ℃培养48 h。挑取两菌单菌落分别接种于3 mL和6 mL TSB中，分别于37 ℃、220 r/min振荡培养18 h和28 ℃、220 r/min振荡培养24 h，连续活化2 次，使菌数达到稳定期。取1 mL培养好的菌液离心（8000×g、5 min、4 ℃），弃上清液，用PBS（pH 7.2）洗涤3 次，调整菌悬液浓度为108CFU/mL备用。

1.3.2 大肠杆菌和假单胞菌生物被膜形成能力测定

将1.3.1节菌悬液用新鲜TSB梯度稀释至浓度为102CFU/mL，吸取180 μL至96 孔细胞培养板中，以无菌TSB为对照，封口膜封口，25 ℃培养72 h。培养结束后，弃去培养液，无菌蒸馏水漂洗3 次，室温干燥30 min。吸取0.25 g/100 mL结晶紫200 μL于微孔中染色30 min，弃去染液，无菌蒸馏水漂洗3 次，使用200 μL体积分数95%乙醇溶液洗脱黏附菌体30 min，采用酶标仪测定570 nm波长处光密度（OD570nm）。每个菌株重复6 次。

将测得的各菌株平均OD值与临界OD值（ODC=对照组OD值＋3 倍标准差[22]）进行比较，对被膜形成能力进行分类：无生物被膜形成能力：OD≤ODC；较弱生物被膜形成能力：ODC＜OD≤2×ODC；中等生物被膜形成能力：2×ODC＜OD≤4×ODC；较强生物被膜形成能力：4×ODC＜OD。

1.3.3 大肠杆菌与假单胞菌混合被膜形成动态曲线分析

根据1.3.2节结果，选取被膜形成能力不同的菌株进行大肠杆菌和假单胞菌混合被膜形成动态过程研究。

1.3.31 大肠杆菌与假单胞菌混合被膜制备

选用食品级304不锈钢片（75 mm×25 mm×1 mm，2B光洁面）作为生物被膜形成的接触载体。将1.3.1节制备的大肠杆菌和假单胞菌悬液单独或共同接种至含新鲜TSB和不锈钢片（一半浸入）的无菌玻璃盒中，分别为单菌生物被膜组和混合生物被膜组，其中两种细菌浓度均为106CFU/mL。无菌保鲜膜封口，25 ℃静置培养12、24、36、72、120 h和168 h。实验重复3 次。

1.3.32 大肠杆菌与假单胞菌生物被膜的收集与计数

培养结束后取出不锈钢片并用无菌生理盐水漂洗3 次以去除表面未黏附菌体，置于均质袋中充分拍打均质（8 次/s、1 min），正反面各拍打1 次[23]。梯度稀释后选择合适稀释度进行涂布，其中大肠杆菌单菌被膜组采用TSA-利福平平板，假单胞菌单菌被膜组采用CFC假单胞菌选择性平板，混合被膜组采用上述两种选择性平板同时进行涂布。涂布结束后大肠杆菌于37 ℃培养24 h，假单胞菌于28 ℃培养48 h后计数。

1.3.4 生物被膜CLSM分析

将编码含有红色荧光蛋白基因的质粒pUC-mcherrystr（3830 bp）[24]和含有编码绿色荧光蛋白基因的质粒sfgfp-MCS（5855 bp）[25]分别转化到大肠杆菌和假单胞菌中。绿色荧光菌和红色荧光菌的检测波长分别为490～550 nm和560～700 nm。采用1.3.3.1节方法制备含有荧光蛋白菌株的单菌被膜和混合被膜，25 ℃静置培养24、72 h和168 h。培养结束后取出不锈钢片并用无菌生理盐水漂洗3 次。采用CLSM观察单菌和混合生物被膜在钢片表面的分布情况。

1.3.5 大肠杆菌与假单胞菌混合被膜形成时EPS含量分析

按1.3.3.1节制备大肠杆菌与假单胞菌单菌被膜和混合被膜，培养72、168 h取出不锈钢片并用无菌生理盐水漂洗3 次。采用棉签擦拭法收集不锈钢片表面生物被膜，擦拭后棉球置于离心管中充分涡旋3 min，得到的菌悬液用于EPS含量测定。实验重复3 次。

参考Cao Bin等[26]的方法制备菌悬液中松散型EPS（loose EPS，L-EPS）和紧密型EPS（bound EPS，B-EPS）。按照BCA试剂盒说明书操作测定L-EPS和B-EPS中的蛋白质含量，以牛血清蛋白为标准品，标准曲线方程为y=0.0018x＋0.1514（R2=0.9978），其中x为蛋白质量浓度/（μg/mL），y为吸光度；根据标准曲线方程分别计算L-EPS和B-EPS中蛋白含量，进而计算出总EPS（total EPS，T-EPS）中的蛋白含量。总糖含量采用苯酚-硫酸法[27]测定，以葡萄糖为标准品，标准曲线方程为y=0.1956x＋0.0818（R2=0.9973），其中x为葡萄糖质量浓度/（μg/mL），y为吸光度，根据标准曲线方程计算L-EPS和B-EPS中多糖含量，进而计算出T-EPS中多糖含量。

1.3.6 生物被膜和浮游菌中相关成膜基因的表达水平测定

采用real-time PCR绝对定量方法测定单菌被膜与混合被膜、单菌培养液与混菌培养液中浮游菌的相关成膜基因表达量变化，分别基于单位面积和单位菌数进行基因表达量分析。

1.3.6.1 生物被膜和浮游菌的收集及培养计数

以食品级304不锈钢片为接触载体，25 ℃静置培养72 h和168 h后收集生物被膜，方法同1.3.3.1节。将均质液离心（12000×g、15 min、4 ℃），沉淀用于核酸提取。同时对不锈钢片上的生物被膜进行选择性平板计数，方法同1.3.3.2节，菌数结果用于生物被膜基于单位菌数基因表达量的计算。

取出钢片后，充分涡旋剩余培养液，吸取2 mL培养液于离心管中，无菌生理盐水离心洗涤3 次并等量重悬（8000×g、5 min、4 ℃），取菌体沉淀用于核酸提取。同时对培养液中的浮游菌进行选择性平板计数，选择性培养基和培养方法同1.3.3.2节，菌数结果用于培养液中浮游菌基于单位菌数基因表达量的计算。

1.3.62 总RNA提取及cDNA合成

按照总RNA提取试剂盒说明书进行，用核酸蛋白微量测定仪测定提取的总RNA浓度和纯度，确定提取的RNA浓度、纯度合格（OD260nm/OD280nm为1.8～2.0），调整RNA浓度后，根据反转录试剂盒进行反转录。反转录体系（10 μL）：2 μL 5×Prime Script RT Master Mix混合液、2 μL RNA、6 μL去RNA酶水。反应程序为：37 ℃、15 min，85 ℃反转录酶失活反应5 s，4 ℃，∞。将反转录得到的cDNA于-20 ℃保存进行后续实验。

1.3.63 成膜基因特异性确定

查阅文献共得到与大肠杆菌成膜相关的基因40 个[28-34]，与假单胞菌成膜相关的基因9 个[35-36]，采用real-time PCR验证每个基因在两种细菌内的扩增情况，并最终确定3 个仅与大肠杆菌成膜相关的基因（csgA、papC、fimH），2 个仅与假单胞菌成膜相关的基因（cbrA、phoR）。各基因引物序列如表1所示，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

表1 实验所用引物序列Table 1 PCR primers used in this study

1.3.64 标准质粒构建及标准曲线建立

标准质粒由南京擎科公司构建合成。取测序结果正确的质粒作为标准检测质粒，采用微量分光光度计测定纯度和浓度，按下式计算质粒DNA拷贝数。

使用去RNA酶水梯度稀释，使标准检测质粒质量浓度为100～10-6ng/μL，作为模板。PCR体系（20 μL）：SYBR Green Master（2×）（ROX）10 μL，PCR正、反向引物（10 μmol/L）各0.25 μL，DNA模板2 μL，双蒸水7.5 μL。反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，40 个循环；溶解程序：95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃停留15 s。以拷贝数对数值（lg（copies/μL））为横坐标，循环阈（cycle threshold，Ct）值为纵坐标，得到标准曲线方程。

1.3.65 相关成膜基因real-time PCR分析

以1.3.6.2节制备的cDNA为模板进行real-time PCR，获得相关基因的Ct值，根据标准曲线方程分别计算单菌生物被膜、混合生物被膜中基于单位面积的基因绝对表达量（copies/cm2），以探讨混合生物被膜形成时接触材料表面基因的绝对表达水平变化。进一步消除菌数差异，分别计算生物被膜、培养液浮游菌的基于单位菌数的基因绝对表达量（copies/CFU），以探讨浮游菌形成生物被膜后菌体的基因表达差异。

1.4 数据处理与分析

利用GraphPad Prism 8软件进行相应数据及图表分析，采用SPSS v17.0（IBM公司）对数据进行单因素方差分析和Duncan多重比较检验，两组之间显著性差异分析采用t检验。结果以±s表示，P＜0.05，差异显著。

2 结果与分析

2.1 大肠杆菌和假单胞菌生物被膜形成能力分析

采用微孔板结晶紫染色法评估25 ℃培养72 h时31 株肉源大肠杆菌的生物被膜形成能力。如图1A所示，31 株肉源大肠杆菌中29 株（93.55%）菌株表现出生物被膜形成能力，但存在显著的菌株差异性（P＜0.05）。进一步对生物被膜形成能力进行分类发现，强、中、弱、无4 种生物被膜表型的菌株数量分别为8、11、10、2 株，分别占菌株总数的25.81%、35.48%、32.26%、6.45%。如图1B所示，13 株肉源假单胞菌于25 ℃培养72 h时，12 株（92.31%）菌株表现出生物被膜形成能力，亦存在显著的菌株差异性（P＜0.05）。进一步对生物被膜形成能力进行分类，强、中、弱、无4 种生物被膜表型的菌株数量分别为3、6、3、1 株，分别占菌株总数的23.08%、46.15%、23.08%、7.69%。

图1 大肠杆菌（A）和假单胞菌（B）微孔板表面生物被膜形成能力Fig.1 Biofilm-forming capacity of E. coli (A) and Pseudomonas (B) on polystyrene microplate surfaces

2.2 大肠杆菌和假单胞菌混合被膜形成曲线分析

根据2.1节结果，选取成膜能力强的大肠杆菌菌株D4-18和C-13与成膜能力强的假单胞菌菌株Y2-11和成膜能力弱的假单胞菌菌株Y2-210进行组合，探究大肠杆菌和假单胞菌不同菌株混合被膜的动态形成过程。

单菌生物被膜形成过程发现，两株大肠杆菌D4-18和C-13成膜动态曲线不完全相同（图2A），在36 h达到最大成膜量6.185（lg（CFU/cm2））和6.833（lg（CFU/cm2）），之后被膜量逐渐减少，而168 h时D4-18被膜量又增加；两株假单胞菌成膜动态曲线差异明显（图2B），Y2-210波动明显，生物膜形成量逐渐增加，至72 h达到最多（6.16（lg（CFU/cm2））），Y2-11增加较快，至36 h时达到最多（6.61（lg（CFU/cm2））），之后维持相对稳定。值得注意的是，根据上述微孔板结晶紫染色法培养72 h结果选取的强被膜形成能力假单胞菌Y2-210和弱假单胞菌Y2-11，与不锈钢片被膜形成情况不完全相符，且二者在不锈钢片表面培养72 h时成膜量相近，分别为6.16（lg（CFU/cm2））和6.33（lg（CFU/cm2））。

混合生物被膜中的大肠杆菌和假单胞菌形成曲线与其各自单菌被膜形成曲线存在较大差异，表明混合成膜时两菌发生交互作用，且在不同成膜阶段表现出不同的交互作用。大肠杆菌C-13被膜形成受假单胞菌Y2-11的影响与成膜阶段有关，而假单胞菌Y2-11一直受到大肠杆菌C-13的抑制（图2C）；大肠杆菌D4-18和假单胞菌Y2-210在培养初期发生相互促进，之后大肠杆菌D4-18始终受到假单胞菌Y2-210的抑制（图2D）。结果表明，两个菌株组合混合被膜形成过程中交互作用的动态变化具明显的菌株差异。

2.3 生物被膜CLSM分析结果

如图3所示，培养24 h，大肠杆菌单菌生物被膜的红色荧光信号呈现一定强度并出现聚集，表明大肠杆菌在不锈钢片表面黏附并聚集，假单胞菌单菌生物被膜的绿色荧光信号弱于大肠杆菌，而混合生物被膜的荧光信号则更弱。培养72 h，单菌培养的大肠杆菌和假单胞菌荧光信号均增多增强，呈现更致密的分布，而混合生物被膜中红色荧光面积和绿色荧光面积均明显少于两种单菌，表明混合培养时两种单菌的生物被膜形成受到抑制。168 h，大肠杆菌和假单胞菌的被膜分布更加致密，而混合生物被膜中两菌的分布不如单菌致密，表明此时仍表现为相互抑制。对比被膜量培养计数结果，生物被膜形成过程中CLSM变化情况与被膜量的变化情况一致。

2.4 大肠杆菌和假单胞菌混合被膜形成过程中EPS的变化

2.4.1 EPS蛋白含量

如图4所示，与72 h相比，168 h单菌生物被膜、混合生物被膜中L-EPS、B-EPS、T-EPS的蛋白含量均显著增加（P＜0.05），表明随着成膜时间延长3 种EPS的蛋白质分泌增多。混合生物被膜中3 种EPS的蛋白含量并非都高于两种单菌生物被膜，但均显著低于两单菌生物薄膜中的EPS蛋白含量之和（P＜0.05），其中72 h和168 h混合生物被膜中T-EPS蛋白含量分别较两单菌生物被膜T-EPS蛋白含量之和减少31%和48%，表明两菌混合成膜时蛋白质的分泌受到抑制。此外，B-EPS的蛋白含量明显低于L-EPS。

2.4.2 EPS多糖含量分析

如图5所示，EPS多糖含量变化与蛋白含量变化类似，随着成膜时间延长L-EPS、B-EPS、T-EPS的多糖含量均显著增多（P＜0.05）。与单菌生物被膜相比，混合生物被膜3 种EPS的多糖含量均显著低于两单菌生物被膜之和（P＜0.05），其中72 h和168 h混合生物被膜T-EPS多糖含量分别比两单菌生物被膜T-EPS多糖含量之和减少38%和56%。表明两菌混合成膜时多糖的分泌受到抑制。此外，B-EPS多糖含量明显低于L-EPS（P＜0.05）。

图5 大肠杆菌D4-18和假单胞菌Y2-2 10生物被膜形成时EPS多糖含量变化Fig.5 Changes of polysaccharide content in EPS during biofilm formation by E. coli D4-18 and Pseudomonas Y2-2 10

2.5 生物被膜和浮游菌中相关成膜基因的表达变化

大肠杆菌D4-18的pap C基因标准曲线方程为y=-3.342x＋36.583（R2=0.993）；fimH基因标准曲线方程为y=-3.359x＋35.867（R2=0.997）；csgA基因标准曲线方程为y=-3.089x＋34.695（R2=0.996）。假单胞菌Y2-210的phoR基因标准曲线方程为y=-4.0661x＋41.946（R2=0.997）；cbrA基因标准曲线为y=-3.802x＋43.178（R2=0.991）；其中x为标准质粒拷贝数的对数值（lg（copies/μL）），y为测得的Ct值。5 种成膜基因标准曲线方程的相关系数R2均大于0.99，Ct值在5～30之间，满足标准曲线要求。

2.5.1 生物被膜中单位面积基因绝对表达量的变化

如图6所示，大肠杆菌、假单胞菌单菌生物被膜形成时，5 种基因均有一定水平表达，且随着成膜时间延长不锈钢片上的表达量增加。与单菌生物被膜相比，混合生物被膜形成过程中假单胞菌phoR、cbrA基因的绝对表达量未发生显著变化，而大肠杆菌3 个基因的绝对表达量发生显著变化，72 hpapC、csgA绝对表达量极显著增加（P＜0.01），168 hcsgA绝对表达量仍极显著增加（P＜0.01），而papC、fimH绝对表达量极显著减少（P＜0.01）。

图6 大肠杆菌D4-18和假单胞菌Y2-2 10单种被膜与混合被膜中单位面积基因表达量的变化Fig.6 Changes of gene expression per unit area in single and mixedspecies biofilms formed by E. coli D4-18 and Pseudomonas Y2-2 10

2.5.2 生物被膜和浮游菌中单位菌数基因的表达差异

考虑到生物被膜与培养液中浮游菌数存在差异，为消除此差异进一步计算生物被膜、培养液浮游菌的单位菌数基因表达量。如图7所示，与浮游菌相比，大肠杆菌单菌生物被膜和混合生物被膜中3 种成膜基因papC、fimH、csgA的单位菌数表达量在72 h和168 h均极显著增加（P＜0.01），表明生物被膜形成时相关成膜基因的表达均显著上调。与单菌培养液中浮游菌相比，混合培养液中的大肠杆菌浮游菌在72 h和168 hcsgA的单位菌数表达量均极显著降低（P＜0.01），papC基因的单位菌数表达量仅在72 h时极显著降低（P＜0.01），而fimH的单位菌数表达量无显著变化，表明混合培养时两菌发生交互作用，对浮游菌中成膜相关基因的表达产生影响。与单菌生物被膜相比，混合生物被膜中papC和csgA的单位菌数表达量在72 h和168 h极显著增加（P＜0.01），表明混合生物被膜形成时papC和csgA表达极显著上调。

图7 大肠杆菌D4-18和假单胞菌Y2-2 10单种被膜与混合被膜中单位菌数基因表达量的变化Fig.7 Changes of gene expression per unit cell number in single and mixed-species biofilm formed by E. coli D4-18 and Pseudomonas Y2-2 10

如图7所示，与浮游菌相比，假单胞菌单菌生物被膜和混合生物被膜中2 种成膜基因phoR和cbrA的单位菌数表达量在72 h和168 h均极显著增加（P＜0.01），表明生物被膜形成时相关成膜基因的表达均显著上调。与单菌培养液中浮游菌相比，72 h时混合培养液中的假单胞菌浮游菌phoR表达量极显著增加（P＜0.01），而cbrA基因表达量显著减少（P＜0.05），其余均无显著变化，表明混合培养时两菌发生交互作用，对浮游菌中成膜基因表达产生影响。与单菌生物被膜相比，混合生物被膜中两种成膜基因phoR和cbrA的表达量在72 h均极显著减少（P＜0.01），表明混合成膜时两种基因表达极显著下调。

3 讨论

食源性致病菌和腐败菌黏附在食品表面并形成生物被膜是食品受到微生物持续性污染的主要来源，给食品工业带来巨大损失[38]。研究表明，大多数食源性细菌例如沙门氏菌（Salmonella）、单核细胞性李斯特菌（Listeria monocytogenes）、气单胞菌（Aeromonas）等均具有一定的生物被膜形成能力，且存在明显菌株差异[39-41]。关于食源性大肠杆菌和假单胞菌的被膜形成能力比较也有相关报道。Bhardwaj等[42]从60 个乳制品和肉类样品中分离出32 株大肠杆菌，发现30 株菌株具有成膜能力，其中15 株成膜能力较弱，存在明显菌株差异。Radovanovic等[43]发现临床环境及乳、肉制品中分离的108 株假单胞菌有98 株可以形成生物被膜，其中68 株具有中等成膜能力，8 株具有强成膜能力。本实验评估25 ℃培养72 h肉源分离菌株的生物被膜形成能力发现，31 株肉源大肠杆菌和13 株肉源假单胞菌中大部分菌株具有一定的生物被膜形成能力，并且具有明显菌株差异。但是，Feng Yuqing等[44]对食品环境中分离的68株大肠杆菌进行生物被膜形成能力分析，结果显示所有菌株均不能形成生物被膜。Lianou等[45]研究发现沙门氏菌生物被膜的形成能力并没有菌株差异。上述关于菌株生物被膜形成能力的报道并不完全一致，这可能是由于生物被膜的形成能力与菌种、菌株来源、培养条件、环境条件等有关[46]。微孔板结晶紫染色法是评价细菌生物被膜形成能力的常用方法，其简便快捷，被广泛应用于实验室细菌生物被膜的检测[47]。然而，Yuan Lei等[48]对从乳制品中分离出的假单胞菌分别采用微孔板结晶紫染色法和基于不锈钢片的平板计数法分析生物被膜形成能力，发现两种方法之间存在中等相关性；而Sadiq等[49]发现两种方法之间没有良好的一致性。本研究采用微孔板结晶紫染色法发现培养72 h大肠杆菌D4-18成膜能力显著高于C-13，而基于不锈钢片成膜72 h C-13被膜量反而显著多于D4-18；同时微孔板结晶紫染色法发现被膜形成能力分别为强和弱的两株假单胞菌，基于不锈钢片成膜72 h并无显著差异，表明两种评估方法结论不一致。不同材质接触面，由于表面粗糙度、疏水性、亲水性等不同，可能影响细胞黏附和生物被膜形成[48]。

混合被膜内不同菌种之间可发生不同交互作用，呈现促进、竞争或中立效应[46]。有研究发现，假单胞菌可以抑制大肠杆菌[50-51]、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[52]、变形链球菌（Streptococcus mutans）和单核细胞李斯特菌等细菌生物被膜的形成[53]。相反，也有报道发现假单胞菌可以促进大肠杆菌[2]、链球菌[54]、气单胞菌[55]和白色念珠菌（Monilia albican）生物被膜的形成。此外，大肠杆菌也有相关报道，它可以促进白色念珠菌、抑制金黄色葡萄球菌等生物被膜的形成[56-57]。本研究中，大肠杆菌和假单胞菌混合成膜时在不同培养时间表现不同的交互作用，且本实验采用两个菌株组合混合成膜，在成膜过程中表现出不同的交互作用变化，表明在混合被膜形成过程中，交互作用的变化与菌株和成膜阶段有关[24]。本实验利用CLSM结合导入荧光蛋白基因的方法较好地观察到混合生物被膜形成过程中发红色荧光大肠杆菌和发绿色荧光假单胞菌微观分布情况，且CLSM变化情况与被膜量培养计数变化情况一致。

生物被膜内的细菌可以通过分泌EPS保护细菌免受恶劣环境的影响[58-59]。EPS是生物被膜中细胞周围的厚基质，既可以与被膜细胞紧密结合形成B-EPS，也可以间接附着在细胞表面形成L-EPS[26]。EPS中胞外多糖可作为胞外基质的基本结构元素，通过相互作用决定生物被膜的机械稳定性和黏附情况，胞外蛋白有助于生物被膜的形成和维持其结构的稳定性。Chen Ping等[60]研究副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）和单核细胞李斯特菌混合生物被膜中EPS化学成分的变化，发现生物被膜EPS中蛋白质和多糖的含量均低于单菌生物被膜，这与本研究结果类似。本实验发现大肠杆菌和假单胞菌混合成膜过程中，L-EPS和B-EPS中蛋白质和胞外多糖的分泌均受到了抑制，这可能是由于大肠杆菌和假单胞菌的相互作用影响蛋白质和多糖的分泌。此外，本研究发现多糖含量的减少程度高于蛋白质，表明胞外多糖是混合生物被膜结构减少的主要原因[60]。

生物被膜形成过程中，由于生存环境和状态的改变以及复杂的相互作用，可能影响成膜基因的表达，进而改变细菌对食品表面的黏附情况，影响食品安全[61-62]。本实验发现，与培养液浮游菌相比，生物被膜形成时大肠杆菌和假单胞菌菌体相关成膜基因的表达均显著上调，表明这些基因参与调控生物被膜形成。混合生物被膜形成过程中相关基因的表达变化大多采用real-time PCR相对定量方法，与报道结果不完全一致；例如，在粪肠球菌（Enterococcus faecalis）存在下白色念珠菌的黏附相关基因表达上调，而粪肠球菌的被膜形成相关基因表达下调[63]。Xu Jingguo等[64]研究肠炎沙门氏菌与副蕈状芽孢杆菌（Bacillus paramycoides）形成双菌生物被膜中菌株的基因表达变化，发现属于肠炎沙门氏菌生物被膜形成和环境抗性途径的基因显著上调。本研究采用绝对定量方法，消除菌数差异后也可反映菌体基因表达差异，发现与单菌生物被膜相比，混合生物被膜形成时大肠杆菌成膜基因papC、csgA的表达均显著上调，而假单胞菌成膜基因phoR和cbrA表达在72 h显著下调。上述关于混合生物被膜形成时相关基因表达变化的报道不完全一致，可能与菌种、菌株、成膜条件等因素有关[46]。本实验相关基因表达量变化与混合成膜过程中交互效应的变化不相符，可能是混合成膜时多个基因共同参与，而本实验采用绝对定量方法，仅分析了大肠杆菌特异性的3 个基因和假单胞菌特异性的2 个基因，关于其他成膜基因的变化尚需进一步研究探讨。此外，本研究基于不锈钢片单位面积基因绝对表达量发现，大肠杆菌、假单胞菌单菌生物被膜形成时，5 种基因均有一定量表达，且随着成膜时间延长不锈钢片上的菌株基因表达量增加；与单菌生物被膜相比，混合生物被膜形成时基因绝对表达量发生不同程度变化，这与大肠杆菌和假单胞菌的生物膜形成量差异及两者之间的交互作用有一定相关性。real-time PCR绝对定量方法不仅可以通过消除菌数差异分析菌体相关基因的表达差异，还可直接定量反映接触表面或生长环境中基因实际表达量，从而为评估环境和食品微生物安全风险水平提供更直接的科学依据。

4 结论

本研究对肉源分离的大肠杆菌和假单胞菌进行被膜形成能力比较，发现存在明显的菌株差异。大肠杆菌和假单胞菌混合生物被膜形成过程中，不同成膜时间表现不同的交互作用变化。生物被膜形成过程中CLSM变化情况与被膜量培养计数的变化情况一致。在混合生物被膜形成过程中，EPS中蛋白质和多糖的分泌受到抑制。采用real-time PCR绝对定量方法分析成膜基因表达量，基于单位菌数基因表达量发现，单菌被膜与混合被膜、生物被膜黏附菌体与培养液浮游菌体相关基因的表达存在差异；基于不锈钢片单位面积基因绝对表达量发现，5 种成膜基因均有一定量表达，混合成膜时基因绝对表达量发生不同程度变化。绝对定量方法不仅可以分析菌体相关基因的表达水平差异，还可直接定量反映接触表面或生长环境中基因实际表达量，从而为评估环境和食品微生物安全风险水平提供更直接的科学依据，这也对今后食源性致病菌生物被膜形成时的毒性评估具有重要指导意义。