不同处理方式对壳聚糖-阿拉伯胶复合颗粒稳定的高内相乳液结构和性能的影响

徐天琳，韩 静，陈凤莲 ，窦新梾，高成成 ，汤晓智

（1.哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江 哈尔滨 150076；2.南京财经大学食品科学与工程学院，江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心，江苏省高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室，江苏 南京 210023）

高内相乳液（high internal phase emulsions，HIPEs）是指分散相体积分数大于或等于74%的乳液，广泛用于食品、医药和化妆品等领域[1]。传统HIPEs一般使用化学合成小分子表面活性剂稳定乳液，用量大，通常为5%～50%[2]。然而，这类物质存在降解性低和潜在毒性。近年来，越来越多的消费者追求天然绿色健康食品，寻求合成表面活性剂的天然替代品成为研究热点。食品级纳米颗粒因其优异的生物相容性、生物降解性、安全性、乳化能力而广泛应用于稳定HIPEs[1]。目前，已开发多种食品级纳米颗粒，如多糖颗粒（壳聚糖（chitosan，CS）[3]、淀粉[4]、纤维素[5]等）、蛋白质颗粒（玉米醇溶蛋白[6]、小麦醇溶蛋白[7]、高粱蛋白[8]等）、多糖-蛋白质复合颗粒（玉米醇溶蛋白-壳聚糖颗粒[9]、玉米醇溶蛋白-玉米纤维胶颗粒[10]等）。

CS是一种线性天然阳离子多糖，由甲壳素脱乙酰化而来[11]，具有无毒、可生物降解、抗菌、成膜等特性，被广泛应用于组织工程、药物释放、食品和化妆品等领域[12]。研究发现在pH值大于CS解离常数（pKa6.5）时，CS会发生自聚集形成具有一定表面活性的纳米颗粒，可以稳定Pickering乳液。各种方法如交联和超声处理被用于进一步提高乳液的稳定性[13]。此外，阳离子CS可以与疏水性阴离子聚电解质相互作用形成表面活性高的纳米颗粒如蛋白质[14]。阿拉伯胶（arabic gum，GA）是从金合欢树枝干中提取出的一种阴离子聚电解质杂多糖，其主要由阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯胶半乳聚糖蛋白复合物（arabica galactoglycan protein complex，AGP）和糖蛋白组成，其中AGP分子质量最高，占GA中胶体的蛋白质含量最高[15]。GA是水包油（O/W）乳液的良好稳定剂，主要与其疏水的AGP片段相关。此外，GA在较宽酸碱范围、高离子强度和高温环境中表现出良好的稳定性[16-18]。当pH值高于2.2时，GA分子链中羧基解离，带负电[19]。带正电的CS和带负电的GA可以通过静电相互作用形成微纳米颗粒。目前，已有较多关于CS和GA复凝聚反应、颗粒制备及其作为微胶囊的应用等研究[20]。本课题组前期研究也发现CS-GA复合颗粒可以稳定低油相的Pickering乳液并表现出优异的贮藏稳定性[21-22]。但是CS和GA均属于聚电解质，其在凝聚反应时受环境影响较大，如pH值、温度、离子浓度等[14-23]。pH值是影响聚电解质络合行为的重要因素。CS在低于或高于pKa的条件下分别处于溶解和自聚集状态，因此会影响与带负电的GA凝聚行为[21]。加热会提高聚电解质凝聚反应程度和结构致密度[24-25]。超声处理是纳米材料合成过程中尺寸细化和分散的有效方法，有研究报道超声处理可以降低CS分子质量，提高CS颗粒稳定乳液的能力[26]。带负电荷的三聚磷酸钠（sodium tripolyphosphate，STPP）离子可以与CS作用发生物理交联反应形成纳米粒子，使用CS-STPP纳米粒子乳化液体石蜡制得的Pickering乳液稳定性得到提升[27]。然而，这些处理对CS-GA复合颗粒稳定乳液性能的影响报道很少。因此，本实验在前期研究基础上，采用不同处理方式，选取最佳参数制备CS-GA复合颗粒，并用其稳定HIPEs乳液，对颗粒的结构与性能及乳液的微观结构、流变性能和稳定性进行考察，旨在提高CS-GA颗粒的乳化性能及乳化稳定性，并实现对乳化体系的结构和性能调控。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

C S（脱乙酰度85%，分子质量4.0×105～5.0×105Da）济南海得贝海洋生物工程有限公司；GA（医药级，分子质量3.0×105Da）上海麦克林生物科技有限公司；菜籽油 益海嘉里金龙鱼粮油食品股份有限公司；STPP 上海源叶生物科技有限公司；尼罗红、尼罗蓝 北京索莱宝科技有限公司；冰乙酸、盐酸、氢氧化钠 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

磁力搅拌器 美国CORNING公司；PHS-3C pH计上海精科实业有限公司；高速分散器 德国IKA公司；冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司；SDC-100S光学接触角测量仪 东莞市晟鼎精密仪器有限公司；Axio Vert.A荧光正置显微镜 德国CarlZeiss公司；H1850R高速冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；SCIENTZ-1500F超声波分散仪宁波新芝生物科技股份有限公司；A1 HD25激光共聚焦显微镜 日本尼康仪器有限公司；MCR302流变仪澳大利亚Anton Paar公司；ZS90纳米粒度仪 英国Malvern公司。

1.3 方法

1.3.1 CS-GA复合颗粒的制备

分别将CS和GA分散在体积分数1%乙酸溶液和超纯水中，磁力搅拌至完全溶解，CS、GA质量浓度均为2.5 g/100 mL，备用。将CS、GA的质量比固定为1∶5。然后将GA溶液缓慢加入至CS溶液中，复合溶液保持恒定的磁力搅拌（800 r/min），使CS与GA络合。为研究不同处理方式的影响，以pH 5.0为参照，分别使用NaOH和HCl溶液调节复合溶液pH值（5.0→7.0）、超声处理（功率450 W、3 min）、热处理（90 ℃恒温磁力搅拌30 min）、STPP交联（向体系中加入终质量浓度0.1g/100 mL的STPP）。所得CS-GA复合颗粒分别记作pH 5.0、pH 7.0、pH 5.0超声、pH 5.0热处理及STPP。

将新鲜制备的CS-GA复合溶液于5000 r/min离心5 min，收集底部沉淀，按式（1）计算复合颗粒的得率：

式中：m沉淀为沉淀中生物聚合物质量/g；m总为添加的生物聚合物总质量/g。

1.3.2 透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）观察

采用TEM观察CS-GA复合颗粒的大小和形态。电子束加速电压120 kV，将质量浓度为0.60 g/100 mL的复合颗粒的新鲜分散液1 mL稀释至10 mL，分散液质量浓度为0.06 g/100 mL，将稀释后的样品沉积到铜网格上。

1.3.3 复合颗粒粒径与Zeta电位的测定

利用纳米粒度仪测定样品的粒径分布与电位。将不同处理方式的复合颗粒分别溶于超纯水中，溶液质量浓度均为1 g/100 mL。然后用超纯水按体积比1∶100振荡稀释，避免多重散射效应。折射率设定为1.456，吸收率为0.001。所有实验均在25 ℃下进行。

1.3.4 接触角测定

采用光学接触角测量装置对CS-GA复合颗粒的亲/疏水特性进行研究。将干燥的CS-GA粉末压制成片后放置在设备平台上，在25 ℃下使用高精度注射器在样品表面沉积2 μL去离子水。所形成的液滴图像通过与设备耦合的数码相机获得。采用Laplace-Young方程对成形液滴的轮廓数据进行拟合，由设备软件自动计算出接触角值。

1.3.5 光学显微镜

采用荧光正置显微镜对CS-GA复合颗粒的微观结构进行表征。将制备好的复合溶液取1 滴至载玻片上观察，放大倍数为5 倍。用Image J软件对乳液的液滴直径进行分析。

1.3.6 HIPEs的制备

将1.3.1节制备的不同处理方式的CS-GA复合颗粒溶液以体积比1∶3与菜籽油混合，经20000 r/min高速分散5 min即制得半固态HIPEs，备用。

1.3.7 共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscope，CLSM）观察

采用CLSM观察HIPEs的微观结构。测试前分别将荧光染料尼罗蓝和尼罗红溶于异丙醇中（质量浓度均为0.1 g/100 mL），在油相中加入尼罗红溶液，在连续相中加入尼罗蓝溶液，然后按照1.3.6节方法制备HIPEs，备用。尼罗红与尼罗蓝的激发波长分别为488 nm和633 nm。

1.3.8 HIPEs的流变性质测定

采用流变仪对HIPEs的静态流变和动态流变特性进行测定。实验参数设定为：50 mm平板，温度（25±1）℃，底座与平板间隔1 mm。在测试频率扫描时，扫描范围0.1～100 rad/s，应变为0.1%。在测试稳态剪切时，剪切速率范围为0.1～100 s-1。

1.3.9 HIPEs的稳定性及油结合能力测定

采用离心法评估HIPEs的稳定性，称取25 g乳液样品于5000 r/min离心15 min，观察离心后样品的油析出情况。乳液的油结合能力按式（2）计算：

式中：m前为离心前样品质量（25 g）；m后为离心后剩余乳化层质量/g。

1.4 数据处理与分析

实验均重复3 次。利用Origin 8.5软件对实验数据进行分析和作图。

2 结果与分析

2.1 CS-GA复合颗粒的表征

如图1所示，与pH 5.0相比，pH 7.0制备的复合颗粒得率显著降低，仅为36.35%。已有研究证明带正电荷的CS与带负电荷的GA主要通过静电相互作用形成聚电解质复合物，pH值会影响聚电解质的解离状态，从而影响复合颗粒的形成[28-29]。当pH值为7.0时，由于此时的pH值大于CS的等电点，分子中氨基质子化程度低，CS发生自聚集，与GA静电相互作用减弱，导致得率降低[19]。与pH 5.0相比，超声处理和热处理复合物的得率显著增加（P＜0.05）。超声过程中产生的空化效应、机械效应和热效应及加热过程中的高温可能促进了CS和GA的溶解，同时增加了CS和GA之间的接触和碰撞频率，从而提高了复合物的得率[30-32]。STPP处理的复合颗粒得率变化不明显。从外观来看，在不同处理方式的离心管中均可观察到明显的凝聚物形成，静置一段时间底部均出现沉淀。

图1 不同处理方式制备的CS-GA复合颗粒的得率Fig.1 Yield of CS-GA composite particles prepared by different treatments

如图2A～D所示，TEM图像表明，复合纳米颗粒呈椭圆形或球形，并聚集成不规则形态。与pH 5.0相比，STPP制备的颗粒及聚集体更大，这可能是由于STPP的交联作用。如图2E所示，pH 5.0制备的复合颗粒受CS影响，Zeta电位为正，约为20 mV[33]。热处理对复合颗粒Zeta电位没有显著影响。与pH 5.0相比，其他3 种方式均使复合颗粒Zeta电位显著下降。在pH 7.0和STPP交联制备的复合颗粒表面Zeta电位的绝对值趋近于0。当pH＞6.5时，CS中大量—解离，并发生CS自聚集，因此溶液中正电荷减少，电荷数趋近于0。STPP交联可能是因为带正电荷的CS除与带负电荷的GA反应外，还与带负电荷的STPP离子作用发生物理交联，导致溶液中正电荷减少，电荷数趋近于0。Sharif等[34]研究表明Zeta电位绝对值越大，体系越稳定，即溶解或分散可以抵抗聚集。pH 5.0、热处理和超声处理制备的CS-GA复合颗粒具有较高的Zeta电位绝对值，有利于防止颗粒聚集。

图2 不同处理方式制备CS-GA复合颗粒稳定HIPEs的TEM图像和Zeta电位Fig.2 TEM images and zeta potential of HIPEs stabilized by CS-GA composite particles prepared by different processing methods

颗粒用作Pickering乳液稳定剂的一个重要前提是分散相和连续相都应部分润湿颗粒，以实现稳定乳液。颗粒润湿性反映了亲水/疏水程度。接触角（θ）用于量化固体颗粒表面的润湿性，并评估Pickering乳液的类型。当θ＜90°时，亲水性颗粒优先形成O/W乳液，当θ＞90°时，疏水性颗粒优先趋于稳定油包水（W/O）乳液。当θ接近90°时，颗粒在油-水界面的吸附能达到最大，可形成O/W和W/O乳液[35]。如图3所示，不同处理方式制备的复合颗粒θ差异较大。在pH 5.0下制备的复合颗粒θ最大，约为58°。据报道，纯CS纳米粒子的θ为（42.47±1.19）°[36]，与纯CS纳米颗粒相比，GA的添加增加了纳米粒子的θ。这是由于GA结构中AGP的疏水性多肽链的存在提高了CS的疏水性。而pH 7.0以及使用STPP交联制备的复合颗粒显示出较低的θ，在pH 7.0条件下CS和GA结合程度低，复合颗粒中GA含量少，同时存在CS自聚集颗粒，导致复合物的θ降低。STPP中的磷酸基团属亲水性基团，磷酸基团的引入可增强多糖的水溶性，因此STPP处理后的复合颗粒θ最低。此外，在pH 5.0下，超声处理和热处理使复合颗粒的接触角显著性降低。

图3 不同处理方式制备CS-GA复合颗粒的接触角Fig.3 Contact angle of CS-GA composite particles prepared by different treatment methods

2.2 复合颗粒稳定的HIPEs的表观形态

从图4可以看出，经3 h放置后，所有样品静置时流动性消失，表现出半固态凝胶特性。这是因为彼此相邻的液滴相互作用形成三维网络结构。此外，残留水相中的CS、GA和复合颗粒之间相互作用也对三维网络的形成产生一定贡献。不同样品的外观无明显差异，但在进行外力切割（机械剪切）时，样品出现不同程度的析油现象。这可能是因为液滴之间相互作用较强，外力作用时，液滴之间不能自由滑动，导致乳液破乳，出现析油现象。

图4 不同处理方式制备CS-GA复合颗粒稳定的HIPEs外观Fig.4 Visual appearance of HIPEs stabilized by CS-GA composite particles prepared by different treatments

2.3 复合颗粒稳定HIPEs的微观表征

如图5所示，所有样品中均观察到液滴的聚集，符合乳液凝胶化的结果。pH 7.0制备颗粒稳定的HIPEs具有最小的粒径，可能是在此pH值下，CS-GA复合颗粒和CS自聚集颗粒共存，CS自聚集颗粒的粒径可能比CS-GA复合颗粒的粒径小，迁移速率快，导致其稳定的乳液粒径最小，但由于颗粒的表面θ和Zeta电位均较低，导致其乳化稳定性较低，很容易破乳。与pH 5.0相比，STPP交联处理使乳液液滴显著增大，并且大小不均匀，可能是STPP交联处理后颗粒表面Zeta电位和润湿性都最低导致。而其他方式制备的HIPEs液滴粒径差异不显著。

图5 不同处理方式制备CS-GA复合颗粒稳定HIPEs的微观形貌（A～E）及粒径（F）Fig.5 Micromorphology (A-E) and particle sizes (F) of HIPEs stabilized by CS-GA composite particles prepared by different treatments

由于不同处理方式制备CS-GA复合颗粒稳定的HIPEs具有相似的微观形貌，因此选取pH 5.0组的HIPEs作为代表进行CLSM分析。如图6所示，红色油滴均匀分布在蓝色的连续相中，红色油滴表面被蓝色荧光层覆盖，表明尼罗蓝标记的CS-GA复合颗粒（蓝色区域）被吸附在油滴（红色区域）表面，证实了O/W乳液的形成。CLSM图像显示乳化油滴聚集形成网络结构，游离的CS-GA颗粒也相互聚集形成网络结构，这是HIPEs成胶的主要原因。此外，由于油滴的压缩堆积，一些油滴发生聚结或变形。Wang Lijuan等[37]在研究CS-玉米醇溶蛋白纳米颗粒稳定的乳液中观察到乳液液滴的变形和合并。

2.4 HIPEs的流变特性

乳化体系食品的流变性能与其应用和加工性能密切相关。如图7A所示，所有乳液均呈现出剪切变稀的假塑性非牛顿流体行为，这可能与剪切速率增加时液滴间的聚集变形和三维网络结构破坏有关。不同处理方式制备的CS-GA复合颗粒会对其稳定的HIPEs液滴之间相互作用产生不同影响，从而导致乳液具有不同的表观黏度。pH 7.0制备颗粒稳定乳液的表观黏度明显高于pH 5.0制备颗粒稳定的乳液，这可能是因为在pH 7.0时复合颗粒的得率最低，体系中存在较多未结合的GA，发挥了增稠剂的作用，导致乳液黏度增加[38]。pH 5.0的热处理、超声处理以及STPP交联的颗粒稳定HIPEs的表观黏度低于pH 5.0颗粒稳定乳液。STPP组乳液表观黏度最低，这可能是因为STPP交联的颗粒结构紧密，同时Zeta电位低，导致颗粒之间相互作用较弱，使乳液的表观黏度最低。超声处理和热处理均使纳米颗粒得率升高，从而有更多的颗粒可能聚集在水-油界面处，使体相中颗粒减少，因此乳液的表观黏度降低[39]。

一般来说，储能模量（G’）与乳液的弹性有关，反映了乳液的固体性质，而损耗模量（G”）与乳液的黏性有关，反映了乳液的液体性质。本实验在线性黏弹性区进行小振幅振荡剪切实验，进行频率扫描以确定G’和G”。如图7B、C所示，所有样品的G’值均高于G”值，表明CS-GA稳定的HIPEs主要以弹性为主，所有乳液体系均具有凝胶状的行为，这进一步证明了HIPEs内部三维网络结构的形成，与外观和微观结构的结果一致[40]。G’随频率的增加而略有增加，表现出较弱的频率依赖性，而G”随频率的增加而增加相对较明显，特别是在高频区，表现出较强的频率依赖性，说明CS-GA稳定的HIPEs结构在高频区不够稳定。不同样品的G’和G”随频率的变化趋势没有明显差异。此外，与pH 5.0相比，pH 7.0、超声和热处理的样品的G’和G”均升高，STPP处理样品的G’和G”均明显降低。pH 7.0乳液的G’和G”较高，这主要由于，一方面乳液粒径较小，另一方面体系中存在更多游离的GA，含有大量的AGP组分吸附在水-油界面，增加了乳液的黏弹性，共同增强体系网络强度[41]。超声和热处理均使纳米颗粒的得率升高，平均粒径减小，更多的小粒径液滴和纳米颗粒聚集成三维网络结构，导致乳液的弹性模量升高[42]。STPP可与两个CS中的氨基交联，使复合颗粒或颗粒聚集体粒径增大，导致颗粒间疏水和静电相互作用均降低，乳液粒径较大，使网络结构减弱，因此乳液G’和G”均降低。

2.5 HIPEs的稳定性

由于HIPEs呈现半固体形态，采用传统稀乳液稳定性评价方式很难观察到样品之间的差异，因此利用离心的方法评估不同处理方式制备CS-GA复合颗粒稳定HIPEs的稳定性。如图8A所示，在pH 7.0和采用STPP交联制备的复合颗粒稳定的乳液经离心后有大量油相析出，超声和热处理有少量油相析出，pH 5.0组无油相析出。图8B显示，与对照组相比，超声处理和热处理制备的复合颗粒均表现出较高的油结合能力，而在pH 7.0和采用STPP交联制备的复合颗粒油结合能力均较弱（＜20%）。这与上述得率、Zeta电位和θ结果相互印证。在pH 7.0和采用STPP交联制备的复合颗粒的表面Zeta电位、θ和得率均较低，从而导致所制备的乳液稳定性较差，在离心条件下HIPEs的结构无法保持。与pH 5.0相比，超声处理和热处理方式制备的复合颗粒的表面θ略低，所以其稳定乳液的离心稳定性略低。值得注意的是，pH 7.0复合颗粒稳定乳液的粒径最小，但是离心稳定性很低，说明乳液粒径大小不是决定乳液稳定性的唯一因素。

图8 不同处理方式制备CS-GA复合颗粒稳定HIPEs经离心后的表观形态（A）及CS-GA复合颗粒的油结合能力（B）Fig.8 Visual appearance of HIPEs stabilized by CS-GA composite particles after centrifugation (A) and oil binding capacity of CS-GA composite particles (B)

3 结论

本实验探究不同处理方式制备CS-GA复合颗粒的得率、性能、表观形态以及微观结构，并考察这些复合颗粒稳定HIPEs的结构、流变性和稳定性。结果表明，不同处理方式对所制备复合颗粒的得率、表面Zeta电位及润湿性能均有不同程度的影响。与pH 5.0相比，超声和热处理方式会使CS-GA复合颗粒的得率显著提高，pH 7.0使CS-GA复合颗粒的得率显著降低，Zeta电位和θ都有不同程度的下降。CLSM结果显示，CS-GA复合颗粒被吸附在油滴表面，乳化油滴聚集形成网络结构，未吸附的CS-GA颗粒也相互聚集形成网络结构。流变特性结果表明CS-GA复合物稳定HIPEs均表现剪切变稀行为。与pH 5.0相比，pH 7.0处理的HIPEs表观黏度增加，其他处理方式均降低。所有HIPEs样品均表现为凝胶特性。与pH 5.0相比，超声和热处理均使HIPEs具有优异的黏弹性，且表现出较高的油结合能力和乳化稳定性，而在pH 7.0和采用STPP交联制备的复合颗粒稳定的HIPEs结构经离心后被明显破坏，大量油相析出，油结合能力较差。上述结果显示在保证乳液体系稳定的前提下，超声处理和热处理可以实现对CS-GA体系结构和性能的调控。