高效液相色谱法同时测定非发酵豆制品中苯甲酸、山梨酸、安赛蜜和糖精钠

◎ 缪少霞

（建德市食品药品检验检测中心，浙江 建德 311600）

我国是大豆的原产地，也是最早生产加工豆制品的国家。传统非发酵豆制品，包括豆腐、豆腐皮、豆腐干、腐竹等，口感细腻、质地柔软、味道鲜美[1]。其蛋白质组分含量较高，包含人体必需的8 种氨基酸成分，可以降低血液中胆固醇的含量，对防止心血管硬化有很好的效果[2]。另外，还含有多种矿物质，能补充钙、铁、镁等无机盐的含量，促进骨骼发育，提高蛋白质的消化吸收率[3]。在非发酵豆制品生产过程中，为增加产品的色、香、味，延长保质期，厂商会添加一定量的食品添加剂。防腐剂和甜味剂广泛应用于食品行业中，且经常被混合添加使用。目前，同时测定食品中防腐剂和人工合成甜味剂的研究较多[4-6]，但应用于非发酵豆制品的报道较少。因此，为探究市售非发酵豆制品是否存在超范围使用食品添加剂，本实验建立了同时测定安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠的高效液相色谱法，检测了市售豆腐干等非发酵豆制品的安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠的含量。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260 高效液相色谱仪系统（配置DAD 检测器）：美国安捷伦科技有限公司；FA2004N 电子分析天平：上海菁海仪器有限公司；Direct-pureup 10 超纯水及RO 纯水组合型一体机：Rephile；KQ-500 超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；sigma 3K15高速离心机：曦玛离心机（扬州）有限公司。

安赛蜜、苯甲酸和糖精钠标准物质（1 000 μg·mL-1），坛墨质检科技股份有限公司；山梨酸标准物质（1.00 mg·mL-1），中国计量科学研究院；甲醇：天津四友精细化学品有限公司，色谱纯；乙酸铵：天津市福晨化学试剂厂，分析纯；乙酸锌：西陇化工股份有限公司，分析纯；亚铁氰化钾：国药集团化学试剂有限公司，分析纯；实验用水为超纯水。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制

亚铁氰化钾溶液：准确称取106 g 亚铁氰化钾，加水溶解并定容至1 000 mL 容量瓶中。

乙酸锌溶液：准确称取220 g 乙酸锌，加适量水溶解，加30 mL 冰乙酸，并用水定容至1 000 mL。

1.2.2 标准储备液的配制

分别吸取10 mL 苯甲酸、山梨酸、安赛蜜、糖精钠标准储备溶液，用水定容至50 mL，配制成浓度为200 mg·L-1的混标液。

1.2.3 标准工作液的配制

分别准确吸取4 种添加剂标准储备液0 mL、0.05 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL 和2.50 mL，用水定容到10 mL，即得4 种添加剂浓度分别为0 mg·L-1、1 mg·L-1、5 mg·L-1、10 mg·L-1、20 mg·L-1和50 mg·L-1的混合标准溶液。

1.2.4 样品制备与提取

称取约2.0 g 样品于50 mL 具塞离心管中，加水25 mL 涡旋混匀，超声20 min 后加亚铁氰化钾2 mL、乙酸锌2 mL，混匀后离心5 min，将上清液转移至容量瓶中，用水定容至50 mL。吸取上清液，经0.22 μm微孔滤膜过滤后，作为供试品溶液。

1.2.5 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温：35 ℃；进样量：20 μL；流速：1 mL·min-1；流动相：甲醇∶乙酸铵溶液=5 ∶95（V/V）；检测波长：230 nm。

1.2.6 样品的测定

准确吸取供试品溶液20 μL 用于进样，按1.2.5 项下条件进行分析，根据保留时间定性，峰面积定量。

2 结果与分析

2.1 标准图谱及样品分析

在1.2.5 色谱条件下，50.0 mg·L-1混标溶液、样品H-9 的色谱图分别见图1、图2。

图1 混合标准溶液的色谱图

图2 样品H-9 的色谱图

2.2 线性关系和灵敏度

按上述实验条件检测混合标准溶液，以横坐标为质量浓度，以纵坐标为峰面积绘制标准曲线。

4 种添加剂在0～50 mg·L-1，各组分线性关系良好，线性回归方程、相关系数及检出限（S/N=3）、定量限（S/N=10）见表1。结果表明，本方法检出限和定量限均小于GB 5009.28ü 2016[7]和GB/T 5009.140ü 2003[8]中的限量，灵敏度较高。

表1 4 种添加剂标准溶液线性关系表

2.3 加标回收和精密度实验

通过在样品H-10（空白样品）中添加3 个质量浓度分别为0.005 g·kg-1、0.010 g·kg-1、0.050 g·kg-1的标准溶液，分别进行6 次重复实验，从而得出加标回收率、精密度。如表2 所示，该条件下4 种添加剂的回收率为96.7%～108.2%，RSD 为0.22%～3.00%。该实验研究表明，本方法的回收率和精密度符合GB/T 27404ü 2008[9]标准要求。

表2 精密度和回收率实验结果表

2.4 样品的测定

按上述处理方法和色谱条件，检测市售10 批次非发酵豆制品豆腐干中苯甲酸、山梨酸、安赛蜜、糖精钠的含量，结果详见表3。在GB 2760ü 2014[10]中规定，非发酵豆制品豆腐干类不允许添加苯甲酸、安赛蜜，山梨酸的最大使用量为1.0 g·kg-1，其中新型豆制品中糖精钠的限量为1.0 g·kg-1。从表3 可以看出，10 批次样品中，有4 批次检出含有安赛蜜，检出率为40%，均为非法添加；1 批次样品检出苯甲酸，检出率为10%，为非法添加；9 批次样品检出山梨酸，均未超出最大使用量；1 批次样品检出含有糖精钠，H-4样品为新型豆制品，在合理添加使用范围内。

表3 实际样品的测定结果表 单位：g·kg-1

3 结论

采用高效液相色谱法同时测定了非发酵豆制品豆腐干中苯甲酸、山梨酸、安赛蜜、糖精钠的含量，结果显示，在0～50 mg·L-1内4 种添加剂的线性关系良好，相关系数均高于0.999，回收率为96.7%～108.2%，相对标准偏差（RSD）为0.22%～3.00%，方法检出限等达到实际检测工作要求。本实验通过对非发酵豆制品豆腐干类中苯甲酸、山梨酸、安赛蜜、糖精钠含量的初步研究调查发现，商家为改善产品感官和品质，延长食品保存期限，存在使用非法添加剂的现象，应引起公众和相关政府部门的注意。