基于VEGF/MAPKs通路探讨益肾养肝明目方对RPE细胞凋亡作用的影响

龚雁，李萌，廖燕红，高健，章晓林，王桑桑

氧化应激指体内氧化代谢不平衡，使炎症反应发生并产生大量的氧化中间产物，包括一氧化氮、活性氧（reactive oxygen species，ROS）以及过氧化氢（H2O2）等[1]。ROS可通过细胞凋亡途径致使细胞死亡，参与促炎和促血管生成的过程[2]，而眼是ROS攻击的主要目标之一。当人暴露于一些特殊环境下，如光照、紫外线、电离辐射、化学污染物和致病微生物等，均能将细胞的原本平衡的氧化还原状态转变为激活状态，从而引起干眼、白内障、青光眼、糖尿病视网膜病变甚至眼部恶性肿瘤疾病[3-8]。一些研究[9-12]表明，中药能够有效地降低视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞的氧化应激，降低炎症因子，改善视网膜病理损伤。益肾养肝明目方（YishenYangganMingmuFormula，YYM）是在驻景丸的基础上，根据笔者临床应用经验加减而成，但其药效和作用机制有待进一步阐明。本研究旨在通过体外细胞实验探究YYM增强RPE细胞抵抗氧化应激的能力，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂和仪器

人视网膜色素上皮（adult retinal pigment epithelium，ARPE）-19（浙江如耀生物有限公司，Rybio-ARPE-19），血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、外源性调节蛋白激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）、磷酸化ERK1/2（phosphorylated ERK1/2，p-ERK1/2）、B细胞淋巴瘤蛋白-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相关蛋白X（Bcl-2-associated X protein，Bax）、细胞色素c（Cytochrome c，Cyc）、β-肌动蛋白（β-actin）抗体（杭州华安生物科技有限公司，ER30607、ET1601-29、ET1603-22、ER0907、ER0602、ET1610-60、R1207-1），p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）、应激活化蛋白激酶/Jun N-末端激酶（stress-activated protein kinase/Jun N-terminal kinase，SAPK/JNK）抗体（美国Cell signaling公司，9212、67096），ROS化学荧光法检测试剂盒（南京建成科技有限公司，E004-1-1），细胞凋亡流式检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，CA1020），康柏西普眼用注射液（成都康弘药业集团股份有限公司，S20130012）。流式细胞仪（美国Life Technology公司，AttuneNxT），多功能酶标仪（美国Molecular Devices公司，SpectraMax M），化学发光成像系统（美国UVP公司，ChemiDoc-It Imaging System）。

YYM药物组成：菟丝子、车前子、太子参、黄芪各15 g，枸杞子、桑葚、女贞子各10 g，熟地黄20 g，蒲黄炭3 g。制备方法：煎药前加适量纯净水，浸泡30～60 min，大火熬开，然后小火煎制20 min，将药液过滤倒出。加水煎第2遍15 min，完成后将2次药液合并，13,000 r/min离心2 min去除沉淀，随后通过旋转蒸发浓缩药液，用超纯水调整药液浓度为1 g/mL，最后使用0.22 μm滤膜过滤除菌，4 ℃保存备用。

1.2 细胞培养

ARPE-19细胞培养在含有10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）和链霉素（0.1 mg/mL）的培养基中，置于含5%二氧化碳的37 ℃恒温细胞培养箱中，每周传代2次。

1.3 药物浓度筛选

将处于对数增殖期的ARPE-19消化后，按每孔8,000个细胞移至96孔板中培养，次日分别筛选H2O2造模浓度、阳性药康柏西普浓度和YYM浓度。（1）H2O2：加入终浓度为100、200、400、800、1,600 μmol/L的H2O2，孵育1 h后，检测细胞光密度（optical density，OD）值，计算存活率；（2）康柏西普：加入终浓度为0.08、0.40、2.00、10.00、50.00 μg/mL的康柏西普，培养48 h后，四甲基偶氮唑盐比色法（methyl thiazolyl tetrazolium assay，MTT）检测细胞OD值，计算抑制率；（3）YYM：加入终浓度为8、40、200、1,000、5,000 μg/mL的YYM药液，培养48 h后，MTT法检测细胞OD值，计算抑制率。

1.4 细胞分组与处理

使用上述筛选得到的最佳浓度处理ARPE-19细胞，将细胞分为6组，（1）空白组（blank group，BG）：正常培养ARPE-19细胞；（2）模型组（model group，MG）：ARPE-19+H2O2；（3）益肾养肝明目方组（YYM group，YYM）：ARPE-19+H2O2+YYM；（4）康柏西普组（conbercept group，CB）：ARPE-19+H2O2+CB；（5）益肾养肝明目方+康柏西普组（YYM+conbercept group，YYM+CB）：ARPE-19+H2O2+YYM+CB；（6）益肾养肝明目方对照组（YYM control group，YYMCG）：ARPE-19+YYM。

1.5 细胞形态观察

将细胞培养液均匀滴在载玻片上，使用相差显微镜将细胞定位在视野中心。调整放大倍数至100倍后，显微镜下观察不同组ARPE-19细胞的形态和生长状态，并拍照记录。

1.6 细胞凋亡检测

收集各组处理后的细胞，依次离心、吸取上清、洗涤。按照试剂盒说明书步骤，加入Annexin VFITC结合液重悬细胞混匀，室温避光孵育10 min。离心弃上清后，再次加入Annexin V-FITC结合液重悬细胞，加入染色液混匀，避光放置。使用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率，每组检测3次，取平均值。

1.7 化学荧光法检测ROS表达

将按照试剂盒说明书，去除细胞培养液，将探针加入培养皿中（终浓度为10 μM），并以只加培养液的细胞作为阴性对照，37 °C孵育25 min，吸去培养液反复吹打细胞，收集细胞悬液并用洗涤2次，800 r/min下离心5 min，吸取上清后重新悬浮细胞，设定激发波长为488 nm，发射波长525 nm，检测各组中的ROS表达。

1.8 Western Blot检测VEGF/MAPKs通路相关蛋白表达

提取各组细胞总蛋白质，测定蛋白浓度。依次经凝胶、电泳、转膜、封闭后，分别加入兔抗VEGF（稀释比例1∶500）、ERK1/2（稀释比例1∶500）、p-ERK1/2（稀释比例1∶500）、Bcl-2（稀释比例1∶500）、Bax（稀释比例1∶500）、Cytochrome c（稀释比例1∶500）、MAPKs p38（稀释比例1∶500）、MAPKs p-p38（稀释比例1∶500）、SAPK/JNK（稀释比例1∶500）、p-SAPK/JNK（稀释比例1∶500）一抗及内参蛋白β-actin（稀释比例1∶1,000），4 ℃孵育过夜。次日洗膜后，山羊抗兔二抗（稀释比例1∶2,500）室温孵育2 h，显影。用Image J软件对图像进行分析。目的蛋白相对表达量=目的蛋白表达量/同一样本内参蛋白表达量。

1.9 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析，符合正态分布和方差齐性的计量资料，以均数±标准差（±s）表示，采用方差分析（ANOVA）进行多组变量间的相互比较，两两比较采用LSD-t检验。当P＜0.05时，认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 药物浓度筛选

2.1.1 H2O20、100、200、400、800、1,600 μM浓度H2O2条件下的ARPE-19细胞存活率依次为（99.33±0.91）%、（95.17±3.56）%、（89.43±4.80）%、（34.51±3.78）%、（9.17±1.74）%、（10.58±2.57）%。6组间细胞存活率比较，差异有统计学意义（F=550.939，P=0.000）。两两比较，与0 μM比较，400 μM条件下的细胞存活率较低（t=25.008，P=0.000），差异有统计学意义，故选择400 μM作为H2O2的诱导浓度。

2.1.2 康柏西普 0、0.08、0.40、2.00、10.00、50.00 μg/mL浓度康柏西普处理后的ARPE-19细胞存活率依次为（100.10±2.05）%、（97.18±0.93）%、（95.07±0.78）%、（120.60±1.61）%、（120.63±3.32）%、（122.02±5.61）%。6组间细胞存活率比较，差异有统计学意义（F=60.414，P=0.000）。两两比较，与0 μg/mL组相比，2.00 μg/mL条件下的细胞存活率较高（t=8.632，P=0.000），差异有统计学意义，故选择2 μg/mL作为阳性药康柏西普的干预浓度。

2.1.3 YYM 0、8、40、200、1,000、5,000 μg/mL浓度YYM处理后的ARPE-19细胞存活率依次为（99.70±1.67）%、（104.41±4.63）%、（121.30±3.61）%、（116.27±5.59）%、（115.90±6.02）%、（114.91±5.72）%。6组间细胞存活率比较，差异有统计学意义（F=8.828，P=0.001）。两两比较，与0 μg/mL组相比，40 μg/mL条件下的细胞存活率较高（t=5.527，P=0.000），差异有统计学意义。当浓度继续增大时，细胞存活率出现下降，故选择40 μg/mL作为YYM的干预浓度。

2.2 YYM对H2O2诱导的AREP-19细胞形态的影响

BG组AREP-19细胞形态呈现正常的梭形，当加入H2O2之后，MG组细胞发生损伤，由原始形态变成圆形，部分细胞从培养皿中脱落，细胞之间的连接下降，提示存在细胞凋亡等现象。而经过YYM和康柏西普预处理的细胞损伤程度较MG组减少，凋亡细胞数量明显下降，表明这2种药物都能有效缓解H2O2造成的细胞损伤。此外，YYM对正常AREP-19细胞无明显损伤，且YYM和康柏西普联用的效果比两者分别单独使用更能缓解细胞皱缩的现象（图1）。

图1 YYM对H2O2诱导的AREP-19细胞形态的影响（相差显微镜，×100）

2.3 YYM对H2O2诱导的AREP-19细胞凋亡的影响

6组间细胞凋亡率比较，差异有统计学意义（F=45.101，P=0.000）。两两比较，与BG组比较，MG组细胞凋亡率较高（t=12.408，P=0.000）；与MG组比较，YYM、CB、YYM+CB组细胞凋亡率均较低（tYYM=6.023，tCB=5.967，tYYM+CB=9.804，均P=0.000）；与YYM+CB组比较，YYM组和CB组凋亡率较高（tYYM=3.781，P=0.003；tCB=3.836，P=0.002），差异有统计学意义（图2、表1）。

表1 YYM对H2O2诱导的AREP-19细胞凋亡和ROS表达的影响（±s，n=3）

表1 YYM对H2O2诱导的AREP-19细胞凋亡和ROS表达的影响（±s，n=3）

注：* 与BG组比较，P<0.05；# 与MG组比较，P<0.05；BG 空白组；MG 模型组；YYM 益肾养肝明目方组；CB 康柏西普组；YYM+CB益肾养肝明目方+康柏西普组；YYM-CG 益肾养肝明目方对照组；ROS 活性氧

ROS相对表达量（%）100.33±7.51 180.99±4.83*132.66±5.28#131.80±7.93#110.24±3.40#103.43±10.04#57.485 0.000组别BG MG YYM CB YYM+CB YYM-CG F值P值细胞凋亡率（%）6.27±0.98 21.99±2.88*14.36±1.20#14.43±1.09#9.57±1.35#6.42±0.86#45.101 0.000

图2 YYM对H2O2诱导的AREP-19细胞凋亡的影响

2.4 YYM对H2O2诱导的AREP-19细胞ROS表达的影响

6组间ROS表达比较，差异有统计学意义（F=57.485，P=0.000）。两两比较，与BG组比较，MG组ROS表达升高（t=14.388，P=0.000）；与MG组比较，YYM、CB、YYM+CB组ROS表达降低（tYYM=8.621，tCB=8.774，tYYM+CB=12.620，均P=0.000）；与YYM+CB组比较，YYM、CB组ROS表达升高（tYYM=3.999，P=0.002；tCB=3.846，P=0.002），差异有统计学意义（表1）。

2.5 YYM对H2O2诱导的AREP-19细胞VEGF/MAPKs通路的影响

6组间VEGF、p-p38、p-SAPK/JNK、p-ERK1/2、Bax、Bcl-2、Cyc蛋白表达水平比较，差异有统计学意义（FVEGF=115.896，Fp-p38=170.325，Fp-SAPK/JNK=108.524，Fp-ERK1/2=110.808，FBax=144.260，FBcl-2=127.571，FCyc=263.139，均P=0.000）。

两两比较，（1）VEGF：与BG组比较，MG组VEGF蛋白表达较高（t=18.569，P=0.000）；与MG组比较，YYM、CB、YYM+CB组VEGF蛋白表达较低（tYYM=9.493，tCB=16.065，tYYM+CB=18.569，均P=0.000），差异均有统计学意义。

（2）p-p38 MAPK：与BG组比较，MG组p-p38 MAPK蛋白表达较高（t=22.097，P=0.000）；与MG组比较，YYM、CB、YYM+CB组p-p38 MAPK蛋白表达均较低（tYYM=8.942，tCB=16.033，tYYM+CB=21.378，均P=0.000），差异均有统计学意义。

（3）p-SAPK/JNK：与BG组比较，MG组p-SAPK/JNK蛋白表达较高（t=17.548，P=0.000）；与MG组比较，YYM、CB、YYM+CB组中p-SAPK/JNK蛋白表达均较低（tYYM=8.683，tCB=15.558，tYYM+CB=17.005，均P=0.000），差异均有统计学意义。

（4）p-ERK1/2：与BG组比较，MG组p-ERK1/2蛋白表达较高（t=18.567，P=0.000）；与MG组比较，YYM、CB、YYM+CB组中p-ERK1/2蛋白表达均较低（tYYM=8.929，tCB=13.890，tYYM+CB=16.583，均P=0.000），差异均有统计学意义。

（5）Bax：与BG组比较，MG组Bax蛋白表达较高（t=20.575，P=0.000）；与MG组比较，YYM、CB、YYM+CB组中Bax蛋白表达均较低（tYYM=8.849，tCB=16.043，tYYM+CB=20.071，均P=0.000），差异均有统计学意义。

（6）Bcl-2：与BG组比较，MG组Bcl-2蛋白表达较低（t=18.879，P=0.000）；与MG组比较，YYM、CB、YYM+CB组中Bcl-2蛋白表达均较高（tYYM=4.863，tCB=6.579，tYYM+CB=11.442，均P=0.000），差异均有统计学意义。

（7）Cyc：与BG组比较，MG组Cyc蛋白表达较高（t=28.196，P=0.000）；与MG组比较，YYM、CB、YYM+CB组中Cyc蛋白表达均较低（tYYM=11.832，tCB=22.028，tYYM+CB=26.560，均P=0.000），差异均有统计学意义（图3、表2）。

表2 YYM对H2O2诱导的AREP-19细胞VEGF/MAPKs通路的影响（±s，n=3）

表2 YYM对H2O2诱导的AREP-19细胞VEGF/MAPKs通路的影响（±s，n=3）

注：* 与BG组比较，P<0.05；# 与MG组比较，P<0.05；BG 空白组；MG 模型组；YYM 益肾养肝明目方组；CB 康柏西普组；YYM+CB 益肾养肝明目方+康柏西普组；YYM-CG 益肾养肝明目方对照组；VEGF 血管内皮生长因子；p38 MAPK p38丝裂原活化蛋白激酶；SAPK/JNK 应激活化蛋白激酶/Jun N-末端激酶；ERK1/2 外源性调节蛋白激酶1/2；Bax Bcl-2相关蛋白X；Bcl-2 B细胞淋巴瘤蛋白-2；Cyc 细胞色素c；β-actin β-肌动蛋白

Cyc/β-actin 1.01±0.09 3.25±0.18*2.31±0.07#1.50±0.07#1.14±0.07#0.96±0.04#263.139 0.000组别BG MG YYM CB YYM+CB YYM-CG F值P值VEGF/β-actin 1.01±0.09 2.79±0.16*1.88±0.11#1.25±0.06#1.01±0.18#0.94±0.03#115.896 0.000 p-p38 MAPK/p38 MAPK 1.01±0.09 3.16±0.15*2.29±0.16#1.60±0.11#1.08±0.12#0.92±0.05#170.325 0.000 p-SAPK/JNK/SAPK/JNK 1.01±0.09 1.98±0.11*1.50±0.04#1.12±0.05#1.04±0.04#0.91±0.04＃108.524 0.000 p-ERK1/2/ERK1/2 1.00±0.08 2.31±0.09*1.68±0.07#1.33±0.13#1.14±0.07#0.91±0.06＃110.808 0.000 Bax/β-actin 1.01±0.09 3.87±0.33*2.64±0.06#1.64±0.14#1.08±0.16#0.89±0.09#144.260 0.000 Bcl-2/β-actin 1.00±0.02 0.34±0.02*0.51±0.01#0.57±0.02#0.74±0.04#1.04±0.09#127.571 0.000

图3 YYM对H2O2诱导的AREP-19细胞VEGF/MAPKs通路的影响

3 讨论

RPE细胞受到长期的氧化应激攻击是年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）发病的关键因素之一，因此，保护RPE细胞免受氧化应激是预防AMD重要方式[15-16]。眼内VEGF水平升高引发RPE通透性增加[17]，而抗VEGF药物治疗，如阿柏西普、雷珠单抗或贝伐珠单抗等已被证实能够缓解AMD[18]。康柏西普是一种新型的诱饵受体蛋白，通过将VEGF受体1和VEGF受体2细胞外结构域与人免疫球蛋白的Fc区融合，可以结合不同的VEGF-A亚型从而产生显著的抗血管生成作用，从而治疗AMD等新生血管相关性疾病[19]。而VEGF在一定程度上能够通过VEGF受体2引起ROS的增加[20]，因此，抑制VEGF受体也是抑制ROS的途径之一。虽然康柏西普具有良好的药效，但是临床使用需要通过玻璃体腔注射，具有一定的风险[21-22]。

YYM是由驻景方加减得到的中药方剂，熟地黄是该药最主要的成分，已有报道[23]表明其具有减轻神经细胞氧化应激的功效；方中菟丝子、女贞子益精强阴；枸杞子滋补肝肾；熟地黄、桑葚滋阴补血；黄芪、太子参合用益气养阴；车前子清热利水明目。相比康柏西普的治疗方式，YYM仅需口服就能达到一定的治疗效果，更易被患者接受。此外，中医学[24]认为，肝与黄斑联系密切。首先，黄斑周围脉络血管丰富而充盈，故肝血的盛衰影响黄斑的功能；其次，视锥细胞和神经节细胞在黄斑部及其周围密度最高，神经纤维形成乳斑束连于视乳头（目系），而肝经上连目系，因此主张从肝论治AMD。YYM经过笔者团队不断改进得到现有的方剂组成，经临床使用后证实，该方有助于改善由氧化应激引起的RPE细胞凋亡，但其对于AMD的作用还有待进一步研究。

为了探究YYM对RPE细胞的氧化应激保护作用的机制，本研究通过体外细胞实验验证。结果显示，H2O2造成的氧化应激降低了AREP-19细胞活力，导致细胞形态发生显著皱缩，增加了细胞凋亡率和ROS生成，而YYM减少了H2O2对ARPE-19细胞氧化应激损伤，减少细胞皱缩，且降低了细胞凋亡和ROS的表达。康柏西普也呈现类似的缓解作用，与XIA JP等[25]的研究结果相似。且YYM联合康柏西普使用能够进一步降低细胞凋亡率，这表明两者联合或可提高治疗效果。

已知康柏西普是通过抑制VEGF起到治疗作用，为进一步研究YYM对RPE细胞保护的潜在机制是否也与VEGF通路相关，本研究通过Western Blot法检测下游蛋白的表达变化。结果表明，YYM组ARPE-19细胞的磷酸化的MAPK（p38、ERK1/2、SAPK/JNK）和下游Bax、Bcl-2及Cytochrome c蛋白发生了显著变化，提示YYM可能通过调节氧化损伤的ARPE-19细胞中的Bax、Bcl-2和Cytochrome c表达来抑制细胞凋亡，这与LIU H等[26]的研究结果相似。Cytochrome c主要以其在线粒体中的功能而闻名，是腺苷三磷酸合成生命支持功能的关键参与者，氧化损伤导致了ARPE-19细胞内线粒体内部存储的细胞呼吸链复合物Cytochrome c的上升。然而，当细胞接受凋亡信号刺激时，Cytochrome c被释放到细胞质中并通过细胞凋亡触发程序性细胞死亡。Cytochrome c介导的细胞凋亡由多层调节控制，Bcl-2家族是最关键的参与者之一。除了在细胞凋亡中的作用外，Cytochrome c还能放大其他凋亡途径产生的信号并参与某些非凋亡功能[27]，但这些作用的深入机制还有待进一步探究。此外，有研究[28]表明，VEGF可能通过蛋白激酶C依赖性途径激活MAPK。康柏西普通过下调VEGF表达来抑制炎症、血管生成和氧化反应[25]，而YYM的潜在的机制需要进一步研究。

综上所述，本研究发现YYM能通过降低VEGF/MAPKs通路相关蛋白的表达，提高H2O2诱导RPE细胞的细胞活性，降低细胞凋亡率和ROS表达，减轻氧化应激损伤。这项研究可为YYM的临床运用提供理论基础，但还需要更多的临床及分子生物学研究探讨更深入的作用机制。