余甘子对肥胖大鼠的安全性评价

木其尔，陈希民，张彧格，陈月晓*

1.北京市营养源研究所有限公司（北京 100069）；2.中国营养学会营养与保健食品分会（北京 100053）；3.北京城市学院生物医药学部（北京 100094）；4.北京市科学技术研究院生物技术与健康研究所（北京 100089）

余甘子（Phyllanthus emblica）也叫油甘子、滇橄榄、牛甘果及回甘子等，属于大戟科叶下珠属，是药食两用的传统药材[1]，作为一味重要的传统民族药被载入1974年版《云南省药品标准》，1978年版《藏药标准》和《中华人民共和国药典》，被广泛应用于我国中医药、民族医药及保健食品[2-3]。其主要用于治疗感冒发热、消化不良、慢性肝炎、高血压、肥胖症、热性水肿和尿频等[4]。余甘子含有丰富的多酚、没食子酸、多糖等活性成分，作为抗氧化、护肝、降脂、降糖等功效物质，被广泛应用保健食品[5-12]。

酚类是余甘子关键生物活性成分，其结构类型分为鞣质类、酚酸类、黄酮类，具有心血管保护、抗肿瘤、抗炎、抑制氧化应激等作用[13-15]。《本草纲目》中记载余甘子“久服轻身，延年生长”，表明古人对余甘子的降脂减肥作用已有认识。余甘子有效降低脂代谢紊乱模型大鼠和正常大鼠血中总胆固醇（TC）重增加指数，提高血中高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）占TC的比值[16]。陈晓兰等[17]研究表明，余甘子能有效降低血中胆固醇和甘油三酯的含量，降低大鼠血中总胆固醇水平，提高高密度脂蛋白胆固醇水平，降低动物体重增加指数，起到降脂减肥的作用，余甘子中的鞣质[18-19]可显著降低肥胖小鼠血脂及其肝脏脂肪病变程度，同时对脂肪合成酶FASN具有显著的降低作用，表明余甘子对脂质代谢具有一定的作用。裴河欢等[20]研究发现，余甘子果粉可有效降低高胆固醇饮食家兔血清中低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、甘油三酯（TG）及TC含量，升高其血清中HDL-C含量，余甘子可有效调节家兔的脂代谢情况，降低其体内脂质过氧化物含量，增强其机体的抗氧化功能，抑制其体内ET-1基因的表达。补充余甘子提取物[21]可改善超重肥胖人群心血管危险因素和血小板聚集。

余甘子作为药食同源，与普通食品相比，一次摄入剂量有限，而中医应用或者保健食品应用法规上并没有相关规定限量要求。余甘子对肥胖的直接作用及其发挥有效作用的剂量缺乏系统研究数据[22]。因此通过肥胖动物模型试验，探索余甘子提取物安全剂量的有效范围，同时比较不同剂量余甘子提取物对肥胖动物模型大鼠的干预作用，为余甘子食物或药物应用安全性提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

余甘子提取物（多酚17.33%、没食子酸6.14%，西安三江生物工程有限公司）。

雄性SD大鼠[SPF级，实验动物质量合格证号110324221103418647，实验动物生产许可证号SCXK（京）2020-0004，体重120±10 g，由北京华阜康生物科技股份有限公司]；SD大鼠高脂饲料及普通维持饲料（北京华阜康生物科技股份有限公司）。

试验动物饲养环境：SPF级屏障；光照12 h明暗交替；实验室温度20.0～26.0 ℃；相对湿度范围40%～70%；饮用纯化水，群笼饲养（每笼5只），自由摄食摄水。

动物伦理：中国疾病预防控制中心职业卫生所审理通过。

水合氯醛（南京金益柏生物科技有限公司）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（AKP）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）及酶免指标瘦素、脂联素、抵抗素测试盒（南京建成生物工程研究所）；RNA提取液、Water Nuclease-Free、RT First Strand cDNA Synthesis Kit、SYBR Green qPCR Master Mix（None ROX）、引物（武汉塞维尔生物科技公司）；三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 主要仪器与设备

METTLER TOLEDO电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；KZ-Ⅲ-FP低温研磨仪（武汉塞维尔生物科技公司）；D3024R台式高速冷冻型微量离心机（DragonLab公司）；CFX荧光定量PCR仪（Bio-Rad公司）；NanoDroP2000超微量分光光度计（Thermo公司）；ELx800光吸收酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）；SW-CJ-1FD超净工作台（苏净安泰公司）；FBZ2001-uP-P标准试剂型纯水仪（青岛富勒姆科技有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 动物模型建立

动物分组：60只SD大鼠适应性喂养1周后，随机分为2组，即空白对照组（NC）10只、肥胖组（FC）50。

剂量设置：以3 g/d作为人体剂量，PE50、PE100、PE200组分别以人体剂量的50，100和200倍作为剂量，即余甘子大鼠剂量分别为2.5，5.0和10.0 g/kg。

空白对照组大鼠全程予以普通维持饲料喂养，肥胖组以高脂饲料喂养。饲养2周后称重，眼内眦静脉采血，分离血清，检测血脂（TC、TG、HDL-C、LDL-C）水平，依据体重及血脂筛选水平一致40只大鼠，随机分为4组，模型对照组（MC）、余甘子1组（PE50）、余甘子2组（PE100）、余甘子3组（PE200），每组10只。

大鼠各试验组按灌胃剂量20.0 mL/kg配制溶液，余甘子干预组分别给予余甘子提取物（2.5，5.0和10.0 g/kg）。空白对照组和模型对照组给予等体积纯化水；PE200组每日2次，其余各组每日1次，连续给样6周。给样期间，每周称重1次，并根据体重调整给样量。

干预6周后，各组大鼠麻醉后取血，离心分离血清冻存，用于指标检测。解剖大鼠并取材，采集大鼠睾周脂肪、肾周脂肪，称重记录，而后置于-80 ℃条件下冻存，用于后续指标检测。

1.3.2 样本采集及指标测定

1.3.2.1 血清学指标

末次干预后，大鼠水合氯醛麻醉，腹主动脉采血，按3 000 r/min离心10 min，分离血清，参考采用酶联免疫吸附法检测标准检测血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C、瘦素、脂联素和抵抗素水平。

1.3.2.2 脂肪系数

大鼠解剖，采集肾睾周脂肪、肾周脂肪，称重。计算肾周脂肪系数、睾周脂肪系数分别为肾周脂肪质量、睾周脂肪质量与大鼠体重之比。

肝脏指标检测，采用酶联免疫吸附法检测肝脏TC、TG、HDL-C的水平。

1.4 数据统计方法

试验数据采用SPSS 20.0进行统计分析，结果以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素分析，组间两两比较是否齐性，方差齐用LSD分析，方差不齐用Dunnett’s T3分析。统计学意义水平设定：P＜0.05表示显著性差异，P＜0.01表示极显著性差异，均可证明数据具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 余甘子提取物干预后动物死亡情况

以人体剂量50，100和200倍余甘子提取物干预大鼠6周，余甘子3组（PE200）组大鼠死亡1只，对照组、模型组及其他干预组大鼠无死亡情况出现。PE200组大鼠死亡原因可能因为200倍高剂量余甘子提取物对大鼠剂量超过大鼠可耐受剂量，或者余甘子提取物溶解度不足，PE200组每日需灌胃2次，频繁操作对大鼠胃黏膜具有一定损伤作用，操作引起大鼠死亡。

2.2 余甘子提取物对体重和体脂的影响

造模后模型对照组（MC）、余甘子组的大鼠体重显著高于正常对照组（NC）。干预第2周开始，MC组大鼠体重显著高于MC余甘子组（P＜0.05），表明50，100和200倍人体剂量余甘子干预对大鼠肥胖具有显著的抑制作用，见表1。对PE50、PE100和PE200进行组间比较发现，大鼠体重在各组之间无显著差异（P＞0.05），肥胖大鼠抑制作用与不同水平的余甘子的剂量间无显著相关。

高脂饲料喂养条件下，MC组睾周脂肪和肾周脂肪重量均显著增加（P＜0.05），与其相比PE50、PE100和PE200干预组大鼠睾和肾周脂肪重量均显著下降（P＜0.05），表明余甘子可有效抑制大鼠体内脂肪的蓄积。对照组、PE50、PE100和PE200干预组大鼠肾周脂肪系数和睾周脂肪系数无显著差异，主要因在高脂饲料喂养条件下，大鼠体内脂肪重量增加的同时其体重也增加，从而未表现出脂肪系数差异。PE50、PE100和PE200组间比较结果显示，100倍人体剂量余甘子干预后，大鼠睾和肾周脂肪质量呈现降低趋势，这与余甘子干预后大鼠体重较低相关，见表2。

表2 余甘子提取物对大鼠脂肪系数和肝脏系数的影响 单位：g

MC组肝脏重量显著高于NC组；PE50、PE100和PE200干预组大鼠肝脏质量和肝脏系数均显著下降（P＜0.05），高剂量的余甘子可显著减少脂肪在肝脏中的蓄积，见表2。

2.3 余甘子提取物对血清学指标的影响

2.3.1 TC、TG、HDL-C、LDL-C水平的影响

造模后，MC组大鼠血脂TC、HDL-C和LDL-C均显著升高（P＜0.05）。余甘子干预后，TC和TG均显著降低（P＜0.05），且随着剂量增加呈现持续下降趋势；余甘子对LDL-C具有降低作用，但未呈现剂量效应关系，见图1。

图1 余甘子提取物对大鼠血清学指标的影响

2.3.2 对血清瘦素、脂联素、抵抗素的影响

瘦素是脂肪组织分泌的激素[23]，在血清中的含量和动物脂肪组织的大小呈正比。MC组瘦素显著高于NC组（P＜0.05）；相比于MC组，高剂量的余甘子干预后，血清瘦素水平显著降低（P＜0.05）。

脂联素是脂肪细胞分泌的内源性生物活性多肽，是胰岛素增敏激素[24]。MC组脂联素显著高于NC组（P＜0.05），脂肪增加过程中脂联素分泌水平增加，对脂肪代谢进行调节。余甘子干预后，PE50组脂联素显著高于NC组，高脂饮食促进脂联素的分泌；余甘子组与MC组无显著差异，表明余甘子对脂联素的调节作用较为有限。

抵抗素由脂肪细胞分泌，降低其对胰岛素的敏感性[25]。MC组血清抵抗素显著高于NC组（P＜0.05），脂肪增加过程中抵抗素分泌水平增加，对脂肪代谢进行调节。余甘子组抵抗素显著高于NC组，但低于MC组（P＜0.05）。高脂饮食促进抵抗素的分泌，但余甘子对抵抗素分泌具有一定抑制作用，见表3。

表3 余甘子提取物对大鼠血清学的影响（）单位：mmol/L

表3 余甘子提取物对大鼠血清学的影响（）单位：mmol/L

组别瘦素脂联素抵抗素NC1.61±0.372.94±0.565.52±0.83 MC2.96±0.52a3.54±0.60a9.32±0.65a PE502.07±0.72b3.73±0.52a7.99±1.56ab PE1002.58±0.89a3.27±0.577.84±1.55ab PE2002.21±0.79b3.47±0.867.54±1.25abimages/BZ_339_1358_941_2138_980.png

表4 余甘子提取物对大鼠肝脏内MDA、SOD、ALT、AST、AKP的影响

2.4 余甘子提取物对各组大鼠肝脏指标的影响

2.4.1 对肝脏内MDA、SOD、ALT、AST、AKP的影响

丙二醛MDA为脂质过氧化的最终产物，MC组肝脏MDA显著高于NC组（P＜0.05），高脂饮食促进肝脏脂质过氧化反应。高剂量余甘子干预后，大鼠MDA显著降低，SOD显著增高（P＜0.05），余甘子通过促进SOD合成作用，清除或抑制脂肪过氧化。组间比较发现，PE200组MDA水平最低，SOD水平最高。

谷丙转氨酶ALT是急性肝细胞损伤的敏感标志，谷草转氨酶AST与碱性磷酸酶APE升高则提示肝脏实质广泛损伤[26]。结果表明，与MC组比较，余甘子干预后肝脏AST和APE水平均降低，尤其是ALT水平显著降低（P＜0.05），余甘子提取物对脂肪蓄积或脂质过氧化引起的肝脏损伤均有保护作用。

2.4.2 余甘子提取物对肝脏内TC、TG、LDL-C水平的影响

肝脏脂质含量检测结果表明，MC组大鼠TC和TG显著升高（P＜0.05），与MC组比较，余甘子组TC、TG及LDL-C均显著降低（P＜0.05），余甘子具有降低肝脏脂质的作用。组间比较结果显示，PE50、PE100和PE200组大鼠肝脏脂质无差异，见图2。

图2 余甘子提取物对肝脏TC、TG、LDL-C水平的影响

3 结论

通过肥胖动物模型试验，探索余甘子对肥胖大鼠的安全性评价。对血清及肝脏指标检测，未发现其对机体的毒害作用，表明最高200倍人体剂量属于动物安全剂量。50，100和200倍人体剂量余甘子干预对大鼠肥胖具有显著的抑制作用，不同干预剂量之间无显著差异。余甘子干预后大鼠体重和血脂均呈现降低，血清及肝脏指标均具有明显改善，说明余甘子具有减重作用，而且不同剂量减肥效果一致。