复合益生菌发酵鲜茶饮料挥发性风味物质分析

陈一萌*，颜麟沣，李鸣，冯德建，杜晓，罗凡

1.四川省食品发酵工业研究设计院有限公司（成都 611130）；2.四川省茶业集团股份有限公司（宜宾 644007）；3.四川大学（成都 610065）；4.中国测试技术研究院（成都 610056）；5.四川农业大学（雅安 625014）；6.四川省农业科学院茶叶研究所（成都 610066）

风味是评价食品质量的重要指标，影响最终产品的质量[1]。茶叶中的主要风味物质为茶汤中溶解的可溶性化合物，包括多酚类、咖啡碱、氨基酸、可溶性糖、有机酸等。发酵茶饮料的风味受到原料、菌种、发酵工艺、熟化过程等多种因素的影响[2-4]。尤其是发酵菌种的差异对产品最终风味影响极大，市面上常见的发酵茶饮料以乳酸菌发酵为主，研究表明经过酵母菌发酵后风味成分会变得更加复杂。

试验选用茶鲜叶为主要原料，以酵母菌结合植物乳杆菌混合发酵制备茶饮料，采用SPME-GC-MS技术检测分析样品中的挥发性风味物质成分，并与由市售菌剂（含植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、瑞士乳杆菌）发酵制备的样品进行对比，探究酵母菌+乳酸菌混菌发酵与市售菌种发酵的茶饮料主要挥发性风味成分的区别，确定益生菌发酵鲜茶饮料中关键挥发物质，为复合益生菌的商业化应用及益生菌发酵鲜茶饮料的研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

鲜茶叶（四川省茶业集团股份有限公司茶叶基地）；蜂蜜（威远县刘青蜜蜂养殖专业合作社）；酵母菌、植物乳杆菌（四川省食品发酵工业研究设计院有限公司）；市售菌剂（含植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、瑞士乳杆菌，安琪酵母股份有限公司）。

1.2 主要仪器与设备

GC/MS-TQ2040气相色谱-质谱联用仪（日本岛津仪器公司）；DGG-9140型电热恒温鼓风干燥箱（上海森信实验仪器有限公司）；TD5A-WS台式离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；HH-6恒温水浴锅（上海力辰邦西仪器科技有限公司）；YXQLS-SH全自动立式电热压力蒸汽灭菌锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；DH-500电热恒温培养箱（北京中兴伟业世纪有限公司）；SW-CJ-1CU洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；ESJ200-4B电子天平（沈阳龙腾电子有限公司）。

1.3 试验条件

1.3.1 益生菌发酵鲜茶饮料工艺流程

新鲜茶叶→挑选→摊放→杀青→切碎→浸提→过滤→调配→杀菌→接种→发酵→杀菌→灌装→成品

挑选干净、无腐烂、无霉变的夏秋茶鲜叶，清洗掉表面灰尘和泥土后在室温25 ℃、空气相对湿度67%～72%环境中摊放4 h；采用滚筒杀青的方式进行杀青，杀青叶摊晾冷却后进行切碎；称取碎茶叶与80 ℃热水按1∶70（g/mL）比例进行混合，并在80 ℃条件下浸提30 min。过滤掉茶叶收集滤液；利用蜂蜜调节茶叶浸提液的糖度至10%，升温杀菌，待液体冷却后接种发酵菌剂，在28 ℃下发酵24 h。升温终止发酵；所得到的发酵鲜茶饮料进行灌装后密封，随即检测其挥发性风味物质。

分别取3.00 g样品，于10 mL顶空瓶中，于60 ℃水浴平衡5 min，顶空萃取55 min。上机解析50 min，开始进行GC/MS检测[5]。

1.3.2 GC条件

色谱柱载气He，流速1.67 mL/min；进样口温度240 ℃；顶空萃取手动进样。升温程序：起始温度45℃，保持3 min，以3 ℃/min 升至150 ℃（保留3 min），以12 ℃/min升至220 ℃（保留3 min）。

1.3.3 MS条件

EI电离源，离子源温度200 ℃，接口温度40 ℃；采用全离子扫描（Scan）模式采集信号。

1.4 数据处理

根据GC-MS得到的总离子图，在NIST11数据库中进行初步比对，将相似度＞80的挥发性风味物质进行定性分析，鉴定出各挥发性风味物质成分，化合物相对含量采用峰面积归一化法进行分析。

2 结果与分析

2.1 SPME-GC-MS测定不同复合益生菌发酵鲜茶饮料中挥发性风味物质

采用SPME-GC-MS方法对2种不同菌种发酵得到的样品组1和样品组2的挥发性风味物质进行分析，主要挥发性风味成分如表1所示。

表1 不同菌种发酵鲜茶饮料的挥发性风味成分及其相对含量

由表1可知，2组不同的发酵剂发酵所得样品共检出挥发性风味物质119种，其中醇类物质42种、醛类物质18种、酯类物质18种、酸类物质14种、酮类物质18种、烯烃类物质2种、酚类物质1种、呋喃类物质2种及其他类化合物4种。由实验室的酵母菌和乳酸菌复合发酵的样品1中检出74种挥发性风味物质，包括醇类33种、醛类8种、酯类13种、酸类6种、酮类6种、烯类2种、酚类1种、呋喃类1种、其他化合物4种；由市售菌种发酵得到的样品2中检出99种挥发性风味物质，其中醇类31种、醛类16种、酯类14种、酸类12种、酮类17种、烯类2种、酚类1种、呋喃类2种、其他化合物4种。相对含量较高的物质是醇类、醛类、酯类以及其他类化合物。样品1中醇类物质含量略高于样品2，分别为39.22%和38.10%，占总体风味成分的较大比例；醛类物质在样品2（28.62%）中含量高于样品1（6.02%）；而样品1（45.67%）中的酯类物质的含量明显高于样品2（8.12%）；样品2中酸类、酮类、呋喃类物质含量分别为5.06%，7.4%和5.49%，均高于样品1，其他类化合物含量相当。

2.2 醇类化合物的比较和分析

醇类化合物是酵母通过糖分解代谢或脱羧反应和氨基酸的脱氨基作用形成的代谢产物，该类物质适宜浓度可衬托出酯香，促进香气的协调性[6]。由表1可知，从样品1和样品2中共检出42种醇类物质，由实验室的酵母菌和乳酸菌复合发酵的样品1中醇类物质含量比由市售菌种发酵的样品2的含量高。前者检出醇类物质33种，含量39.22%，后者检出31种，含量38.10%。其中，正己醇、(Z)-3-己烯-1-醇、(E)-2-己烯-1-醇、顺式-5-乙烯基四氢-α,α, 5-三甲基-2-呋喃甲醇、1-辛烯-3-醇、芳樟醇、苯甲醇、苯乙醇等22种醇类均在2组样品中检出。苯乙醇是样品1含量最高的醇类物质，含量为19.71%，样品2中含量仅1.75%，苯乙醇是莽草酸衍生物，具有玫瑰花香、蔷薇花香、香粉味[7]。芳樟醇是样品2中含量最高的醇类，含量为10.13%，样品1中含有3.16%，表现出较甜的玫瑰香，是绿茶、乌龙茶、红茶等茶叶香气中的重要成分。正己醇在2组样品中含量分别为1.37%和1.76%，具有青草香，是茶叶中常检测出的风味物质。异戊醇只在样品1中检测出，含量为3.69%，异戊醇具有苹果白兰地香气，可能是酵母菌发酵所产生的风味成分[8]。

2.3 酯类化合物的比较和分析

酯类物质主要来源于乙醇发酵，具有水果香气，是对样品风味有很大影响的一类呈发酵香味的化合物。试验中，样品1中酯类物质含量最高，为45.67%，明显高于样品2的8.12%。样品1中检出13种酯类，其中乙酸2-苯乙酯含量高达42.38%，其次为己酸乙酯，含量为1.82%；样品2中检出14种酯类，含量最高的是甲酸辛酯（2.03%），其次为乙酸2-苯乙酯（1.59%）。乙酸2-苯乙酯是样品1的主要风味成分，具有玫瑰花香、蜂蜜香，研究表明该成分是组成乌龙茶香气的重要成分[9]，可见样品1中酵母菌和乳酸菌复合发酵可以有效促进该成分的产生。己酸乙酯具有青苹果的香气，只在样品1中检测出；甲酸辛酯具有较甜的水果香气，但未有相关报道；乙酸己基酯、乙酸苯甲酯、水杨酸甲酯等一般存在于鲜茶叶或晒干的茶叶中，有研究表明乙酸苯甲酯是茉莉花茶香气的重要成分[10]，这几种成分均在样品1中检测出。

2.4 醛酮类化合物的比较和分析

醛酮类物质可通过醇氧化形成，可为样品提供水果香，但这类化合物不稳定，会进一步氧化成羧酸，使其含量降低[11]。研究表明，部分醛类、酮类物质对发酵产品的香味有消极影响[12]。样品1中检出醛类8种，含量为6.08%，样品2中检出酮类17种，含量为28.62%。壬醛、糠醛、苯甲醛、苯乙醛、4-乙基苯甲醛共同存在于2组样品中，这类化合物的风味阈值一般较低，在2.0 μg/L左右，其中苯甲醛呈苦杏仁味、壬醛呈皂味、糠醛呈焦香味。芳香醛中苯乙醛的阈值（4 μg/L）要远远低于苯甲醛（100～4 600 μg/L），因此对风味贡献更大[13]。苯乙醛是样品2的主要风味成分，含量为11.89%，对样品2的风味有较大影响。酮类化合物含量较低，分别为0.52%和7.40%，其中样品1中仅检出6种，样品2中检出18种，只有5种是两者共有。酮类风味阈值一般较低，α-紫罗兰酮的阈值为2.6 μg/L，具有花香、木香等风味[14]，是茶叶中常见的风味成分，在2组样品中均检出，含量分别为0.11%和0.23%。结果表明，样品1中醛酮类物质种类和含量均低于样品2。

2.5 酸类化合物的比较和分析

酸类物质大部分是由酵母或乳酸菌发酵的副产物，有研究发现，酸类物质含量在合适范围内时，对发酵产品的感官品质有积极贡献，浓度太高时会产生酸涩味和腐臭味[15]。其可与醇类物质发生反应，形成酯类，使产品香气更加协调、平衡[16]。样品1和样品2中分别检出6种和12种酸类，其中4种为共有，分别为2-乙基己酸、辛酸、壬酸、十二酸。辛酸具有奶酪味、腐败味和涩味，壬酸具有淡的脂肪和椰子香气，十二酸微有月桂油的气味，这些酸类成分会产生不愉快的气味。同时，从样品2中检出0.45%的乙酸，乙酸具有较刺激的酸味，通过对2个样品组进行感官评价，能明显感受到样品2具有较为刺激的酸涩味。

2.6 烯烃类、酚类、呋喃类以及其他类化合物的比较和分析

烯烃类化合物风味阈值较高，对风味贡献较小。酚类化合物浓度较高时可赋予产品类似药的香气。2组样品均只检出2, 4-二叔丁基苯酚一种酚类物质，且含量均较低。呋喃类化合物具有烧焦、甜的气味，对产品风味有一定消极影响，样品1中仅检出反式芳樟醇氧化物（呋喃类）1种，样品2中检出反式芳樟醇氧化物（呋喃类）和2, 3-二氢苯并呋喃2种。在2组样品中还检出4种其他类化合物，两者含量相当。

3 结论

试验采用SPME-GC-MS法对不同菌种发酵的茶食品中挥发性风味物质进行检测分析。由酵母菌和乳酸菌复合发酵的样品1中检出挥发性风味物质74种，包括醇类33种、醛类8种、酯类13种、酸类6种、酮类6种、烯类2种、酚类1种、呋喃类1种、其他化合物4种；由市售菌种发酵得到的样品2中检出挥发性风味物质99种，其中醇类31种、醛类16种、酯类14种、酸类12种、酮类17种、烯类2种、酚类1种、呋喃类2种、其他4种。样品1中醇类物质和酯类物质的含量高于样品2，占总体风味成分的绝大比例；样品2中醛类、酸类、酮类、呋喃类物质含量高于样品1，其他类化合物含量相当。样品1中主要的挥发性风味物质是苯乙醇、异戊醇、芳樟醇、乙酸2-苯乙酯、2, 4-二甲基苯甲醛等，这类物质为样品1提供丰富且宜人风味，由酵母菌和乳酸菌复合发酵使样品1中醛酮类、酸类、呋喃类等对风味有消极影响的风味成分减少。对比样品2，其主要挥发性风味物质是芳樟醇、香叶醇、苯乙醛、(E)-2-己烯醛、苯甲醛、甲酸辛酯等，醛酮类、酸类物质较多，不愉快风味增加。